جداسازی، شناسایی مولکولی و ارزیابی ایمنی باکتری‌های اسید لاکتیک پروتئولیتیک به دست آمده از نمونه‌های مختلف شیر خام

برخی از باکتری های اسید لاکتیک موجود در شیر خام به ویژه انواع پروتئولیتیک، خصوصیات تکنولوژیک مفیدی دارند و نقش مهمی در توسعه ویژگی های محصول نهایی بازی می کنند، اما غالبا در طی فرآوری از بین می روند. از این رو، جداسازی و نگهداری آنها به منظور کاربردهای بعدی ارزشمند خواهد بود. در این پژوهش، پس از جداسازی باکتری های اسید لاکتیک موجود در شیر خام گاو، گوسفند و بز بر روی محیط های کشت mrs agar و m17 agar، جدایه های گرم مثبت و کاتالاز منفی انتخاب شده و از نظر فعالیت پروتئولیتیکی روی محیط skim milk agar غربال شدند. جدایه های دارای فعالیت پروتئولیتیکی مناسب با استفاده از توالی یابی قطعه ژنی 16s rdna شناسایی شدند و فعالیت همولیزی و مقاومت آنتی بیوتیکی آنها در برابر 10 آنتی بیوتیک رایج مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز توالی یابی با برنامه blast منجر به شناسایی lactobacillus delbruekii (5 جدایه)، l. delbruekii زیرگونه bulgaricus، l. fermentum، l. reuteri، l. curvatus، lactococcus lactis زیر گونه lactis، و streptococcus lutetiensis شد. از میان جدایه های شناسایی شده، l. lactis زیر گونه lactis پس از 48 ساعت گرمخانه گذاری در 37 درجه سانتی گراد با ایجاد قطر هاله 23 میلی متر بیشترین فعالیت پروتئولیزی را نشان داد. در مورد فعالیت همولیزی، فقط lactobacillus fermentum فعالیت آلفاهمولیزی نشان داد و سایر باکتری ها غیر همولیتیک بودند. تمام جدایه های شناسایی شده به تتراسایکلین، آمپی سیلین، اریترومایسن، ونکومایسین و جنتامایسین حساس بودند به جز l. reuteri و lactococcus lactis زیرگونه lactis که به ترتیب به ونکومایسین و جنتامایسن مقاوم بودند. در مورد مقاومت به پنی سیلین، کلرآمفنیکول، کلیندامایسین، کانامایسین و استرپتومایسین نتایج بسته به نژاد مورد بررسی متفاوت بود. نتایج این پروژه، نشان دهنده تنوع نژادهای باکتری های اسید لاکتیک پروتئولیتیک در شیر خام است. به علاوه، اگرچه باکتری های اسید لاکتیک ایمن در نظر گرفته می شوند و در لیست gras قرار دارند، اما نژادهای وحشی جداسازی شده از شیر خام باید از نظر جنبه های مرتبط با ایمنی مورد بررسی قرار گیرند.

Isolation, molecular identification and safety assessment of proteolytic lactic acid bacteria obtained from different raw milks

Some lactic acid bacteria (LAB), in particular proteolytic strains, in raw milk have useful technological properties and play important role in developing desired characteristics in the final products. However, they are mostly lost during heating and technological processes. Therefore, it would be important to be isolated and maintained for further applications as pure adjunct cultures. In this study, after selective isolation of LAB from raw cow’s, ewe’s and goat’s milks on MRS agar and M17 agar, Grampositive catalasenegative were selected and maintained as pure cultures. Then, the isolates were screened according to their proteolytic activities on skim milk agar (welldiffusion method). The potent Grampositive, catalasenegative proteolytic strains were identified via 16S rDNA gene sequencing and antibiotic resistance (10 antibiotic agents, discdiffusion method) and hemolytic activities (on blood agar containing 5% sheep blood) were evaluated. BLAST analysis resulted in identification of Lactobacillus delbruekii (five isolates), L. delbruekii subsp. bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, L. curvatus, Lactococcus lactis subsp. Lactis, and Streptococcus lutetiensis. L. lactis subsp. Lactis obtained from cow milk showed the highest proteolytic activity as a 23mm halo zone was observed on skim milk agar plate after 48 h incubation at 37 °C. In case of hemolysin production, only Lactobacillus fermentum showed αhemolytic activity and the others showed no activities. All the identified isolates were sensitive to tetracycline, ampicillin, erythromycin, vancomycin and gentamycin with the exception of L. reuteri and lactococcus lactis subsp. lactis that found to be resistant to vancomycin and gentamycin, respectively. About penicillin, chloramphenicol, clindamycin, kanamycin and gent streptomycin, the results were varied. Our results verified diversity of wild proteolytic LAB strains in raw milk, as reported before. Although LAB mainly belong to the GRAS list, strains isolated from raw milk should be rechecked for their safetyrelated properties.