بهینه سازی توالی ژن رنین گاوی و تهیه سازه ژنی مناسب برای تولید کیموزین در مخمر pichia pastoris

کیموزین حیوانی به عنوان موثرترین آنزیم برای تولید پنیر مطرح است که این امر به دلیل کیفیت بسیار مناسب بافت و عطر و طعم پنیر تولید شده می باشد. با توجه به تقاضای روز افزون نسبت به این آنزیم نیاز است در کنار سایر منابع گیاهی و میکروبی از منابع نوترکیب نیز برای تولید این آنزیم استفاده گردد. در این پژوهش به منظور تولید نوترکیب کیموزین، و نیز بهبود بیان ژن کیموزین گاوی در مخمر، ابتدا توالی ژن کیموزین بر اساس کاربرد کدونی (codon usage) مخمر پیچیا پاستوریس بهینه سازی و سنتز گردید. پس از بهینه سازی توالی نوکلئوتیدی، شاخص انطباق کدونی (cai) از 0.59 به 0.72 افزایش پیدا کرد در حالی که، توالی ژنی 83% با توالی بهینه شده مطابقت داشت. تعداد کدون های نادر با فراوانی کم تر از 10% قبل از بهینه سازی 41 عدد بود که پس از بهینه سازی هیچ کدونی با فراوانی کم تر از 10% یافت نشد. به منظور انتقال ژن کیموزین a به وکتور بیانی ppic9 مخمری، ژن سنتز شده کیموزین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در وکتور ptg19 همسانه سازی گردید. کلونی های نوترکیب از طریق روش غربالگری کلونی های سفیدآبی گزینش شدند. ژن کیموزین با استفاده از آنزیم های not i و ecor i از وکتور ptg19chyma برش داده شده و در وکتور ppic9 برش یافته با همان آنزیم ها همسانه گردید. کلونی های نوترکیب ppic9-chyma با استفاده از تکنیک کلونی pcr شناسایی و انتخاب شدند. ماهیت نوترکیبی و درج صحیح ژن کیموزین در وکتور بیانی مخمری ppic9 از طریق استخراج پلاسمید و برش با آنزیم برشی bamh i مورد تایید قرار گرفت.

Optimization of calf rennin gene and construction of gene construct for the recombinant chymosin production in Pichia pastoris

Animal chymosin due to the high quality of cheese texture and flavor is the most effective enzyme for cheese production. Due to the increasing demand for this enzyme, in addition to the plant and microbial sources, recombinant sources should be considered for chymosin production. In this study, in order to produce recombinant chymosin, as well as improving the expression of bovine chymosin gene in yeast, the sequence of the chymosin A gene was optimized and synthesized based on the codon usage of the Pichia pastoris and was cloned in an appropriate expression vector. The codon adaptation index (CAI) increased from 0.59 to 0.72 after codon optimization. There were 41 yeast rare codons (with frequency of less than 10%) in the bovine chymosin A gene, whereas no rare codons in the codon optimized sequence. In order to transfer the resynthesized chymosin A gene to the yeast expression vector pPIC9, this gene was proliferated using the specific primers and was cloned in the PTG19 vector. Recombinant (PTG19chymA) colonies were selected by the screening of whiteblue colonies method. The resynthesized chymosin A gene was then cut from PTG19chymA vector using the restriction enzymes Not I and EcoR I, cloned into the pPIC9 vector and was transformed into DH5α strain of E. coli. Colonies containing recombinant vector (pPIC9chymA) were identified and selected using colonyPCR technique. The recombinant nature and correct insertion of resynthesized chymosin A gene in the yeast expression vector pPIC9 were confirmed by plasmid extraction and its digestion with BamH I enzyme.