انتقال و بیان ژن Gnrh نوترکیب ماهی در باکتری Bl21 E. Coli به منظور تولید هورمون نوترکیب

هورمون آزاد کننده گنادوتروپین (gnrh) یک نوروپپتید موثر در تنظیم فرآیند تولیدمثل در مهره داران می باشد. آنالوگ های مختلفی از این هورمون به فرم سنتتیک با نیمه عمرهای مختلف برای تکثیر مصنوعی آبزیان در بازار موجود می باشند. هدف از این تحقیق بررسی بیان gnrh نوترکیب در باکتری escherichia coliسویه bl21 به منظور تولید هورمون نوترکیب می باشد. در این تحقیق، توالی dna مربوط به پپتید gnrh طراحی شده در وکتور بیانی pet28a+ کلون شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) به کمک آغازگرهای اختصاصی صحت کلونینگ را نشان داد. وکتور نوترکیب pet28a+/gnrh به باکتری بیانی e. coli bl21 (de3) انتقال داده شد و صحت انتقال با کلونی pcr سنجیده شد و باند 186 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن بر ژل آگارز مشاهده گردید. سپس برای بررسی بیان، باکتری نوترکیب در محیط luria bertani (lb) حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شد و با غلظت یک میلی مولار isopropyl β-d-1-thiogalactopyranpside (iptg) القاء شد و بعد از القاء، باکتری در دو دما و زمان مختلف شامل 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و 24 ساعت در دمای 20 درجه سانتی گراد قرار گرفت. میزان بیان به کمک الکتروفورز ژل sdspage تعیین شد. بررسی sdspage نشان دهنده بیان پپتید بوده و باند هشت کیلودالتونی مربوط به پپتید مورد نظر بر روی ژل قابل مشاهده بود. همچنین میزان بیان پپتید در دمای 20 درجه سانتی گراد بیشتر از دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد. با توجه به نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر می توان نتیجه گرفت که هورمون gnrh قابلیت تولید در سیستم بیانی پروکاریوتی همانند اشریشیاکلی را دارد و پس از خالص سازی می تواند به عنوان یک همولوگ خاص برای درمان اختلالات تولید مثلی در آبزیان معرفی گردد.

Transformation and gene expression study of recombinant fish GnRH in E. coli BL21 in order to produce recombinant hormone

Gonadotropin releasing hormone (GnRH) is a neuropeptide known to regulate reproduction in vertebrates. Different analogues of synthetic GnRH are used to induce final sexual maturation in fish breeders. The purpose of this research was to evaluate the expression of recombinant GnRH (rGnRH) in Escherichia coli BL21 to produce recombinant hormone. In the present research, the sequence of DNA related to designed fish GnRH was cloned in pET28a+. The cloning was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and specific primers. Recombinant vector pET28a+/GnRH was transformed into the expression host, E.coli BL21 (DE3). The transformation was confirmed using colony PCR. The transformed bacteria were cultured in LB medium containing kanamycin antibiotic at 37 °C at overnight then, induced with 1 mM IPTG. After induction, the bacteria were cultured in two different times and temperatures including 37 °C for 6 h and 20 ° C for 24 h. The protein expression was determined by SDSPAGE analysis. A band of expected size (186 base pair) of amplification from the gene transmitted to the bacteria was detected on the agarose gel. The 8kD band of peptide expression was observed in the SDSPAGE gel and the expression level in 20 ° C for 24 h was higher than 37 ° C for 6 h. The result showed that GnRH from fish had the possibility of producing in the prokaryotic expression system and after optimization, it can be introduced as a specific homologous for the treatment of reproductive disorders in fish.