طراحی، ساخت و بررسی کیت تشخیصی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی(real-time pcr) کووید19

زمینه و هدف: تشخیص دقیق و حساس rna کووید19 از ارزش تشخیصی بسیار بالایی برخوردار است. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی(real-time pcr) دقیق‌ترین تست تشخیصی(استاندارد طلایی) کووید19 شناخته می‌شود که rna یا ماده ژنتیکی اختصاصی ویروس را ردیابی می‌کند و می‌تواند ویروس را طی چند روز پس از ابتلا به عفونت تشخیص دهد. لذا هدف از این مطالعه, تعیین و طراحی یک روش حساس بر پایه real-time pcr برای تشخیص کووید19 می‌باشد.روش بررسی: این یک مطالعه تجربی کاربردی می باشد. تمامی نمونه‌گیری‌ها و تست‌های آزمایشگاهی در مرکز آموزشی درمانی امام رضا(ع) لارستان، آزمایشگاه مولکولی تشخیص کرونا دانشکده علوم پزشکی لارستان و مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی دانشکده علوم پزشکی لارستان در سال 1400 انجام شد. آغازگرها و کاوشگر اختصاصی کووید19 برای جایگاه ژنی ژن‌های n و rdrp به وسیله نرم افزار الیگو 7 طراحی و سپس با استفاده از سایت ncbi بلاست شد. پس از سنتز آغازگرها و کاوشگرها، کیت real-time pcr بر روی 100 نمونه مثبت امتحان و تست‌‍‌های حساسیت(sensitivity)، اختصاصیت(specificity)، پایداری(stability) و اعتبارسنجی(validation) انجام شد. داده های جمع آوری شده با استفاده از آزمون حساسیت و اختصاصیت بالینی تجزیه و تحلیل شدند.یافته‌ها: کیت طراحی ‌شده در این مطالعه قادر به شناسایی تمامی نمونه‌های مثبت کووید19 بود. در تست تعیین حساسیت، میزان حد تشخیص (limit of detection; lod) کیت تشخیصی کووید19 تولید شده در این مطالعه 40 کپی در میلی‌لیتر گزارش شد. با بررسی نمونه‌های منفی و مثبت، اختصاصیت و دقت این کیت 100 درصد بوده، فقط قادر به شناسایی ویروس کووید19 بوده و تکرارپذیری بالا را نشان می‌دهد. کیت به‌خوبی شوک دمایی را تحمل کرده و دارای پایداری بالایی می‌باشد. علاوه‌براین، تفاوت معنی داری بین کیت تولید شده در این مطالعه و کیت‌ تجاری خارجی وجود ندارد.نتیجه‌گیری: با توجه به سطح حساسیت، اختصاصیت و هم چنین دقت و پایداری مناسب در مقایسه با کیت‌های مشابه، این کیت می‌تواند برای تشخیص موثر ویروس کووید19 مناسب باشد.  

design, synthesis, and evaluation of in-house covid-19 real-time pcr diagnostic kit

1.farnoosh g, alishiri g, hosseini zijoud sr, dorostkar r, jalali farahani a. understanding the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) and coronavirus disease (covid-19) based on available evidence - a narrative review. journal of military medicine 2020; 22(1): 1-11.2.stein ra. the 2019 coronavirus: learning curves, lessons, and the weakest link. int j clin pract 2020; 74(4): e13488.3.murdoch dr, french np. covid-19: another infectious disease emerging at the animal-human interface. n z med j 2020; 133(1510): 12-5.4.yuki k, fujiogi m, koutsogiannaki s. covid-19 pathophysiology: a review. clin immunol 2020; 215: 108427.5.huang c, wang y, li x, ren l, zhao j, hu y, et al. clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in wuhan, china. lancet 2020; 395(10223): 497-506.6.habas k, nganwuchu c, shahzad f, gopalan r, armaghane-danesh, yasuj university of                                                                                  original article 1056 1056  medical sciences journal (yumsj)design, synthesis, and evaluation of in-house covid-19 real-time pcr diagnostic kitzare mr1, ebrahimifar z2,  sobhani lari m3, shokrollahnia roshan h4, abdollahpour-alitappeh m5*1department of environmental health engineering, larestan university of medical sciences, larestan, iran,2student research committee, larestan university of medical sciences, larestan, iran,3cellular and molecular biology research center, larestan university of medical sciences, larestan, iran,4department of molecular virology, laboratory of dr tayibi, qaimshahr, iran,5department of physiology and pharmacology, pasteur institute of iran, tehran, iranreceived: 24 nov 2023    accepted: 15 sep 2024abstractbackground & aim: accurate and sensitive detection of covid-19 rna has a highly diagnostic value. real-time polymerase chain reaction (real-time pcr) is known as the most accurate diagnostic test (a gold standard) used for the diagnosis of covid-19, having the ability to detect the specific rna of the virus within a few days of infection. therefore, the aim of this study was to design a sensitive method based on real-time pcr for the detection of covid-19.methods: in the present experimental-applied study, all samplings and laboratory tests were carried out at imam reza hospital, molecular laboratory for corona diagnosis and cellular and molecular biology research center from larestan university of medical sciences, fars province, iran, in 2021. primers and probes of covid-19 for n and rdrp genes were designed and blasted using the oligo 7 software and the ncbi website, respectively. after synthesis of the primers and probes, real-time pcr was performed on 100 positive test samples, followed by determination of sensitivity, specificity, stability, precision and validation of the newly-developed kit. the collected data were analyzed using clinical sensitivity and specificity tests.results: the kit developed in the present study was able to identify all the positive samples of covid-19. in the sensitivity test, the limit of detection (lod) of the covid-19 diagnostic kit was found to be 40 copies/ml. by examining the negative and positive samples, the specificity and accuracy of this kit were found to be 100%, and the kit was only able to identify the covid-19 virus and showed high reproducibility. temperature shock could not negatively affect the stability and potential of the kit. in addition, there was no significant difference between the kit developed in this study and the non-native commercial kits.conclusions: due to its appropriate sensitivity, specificity as well as accuracy and stability compared with similar kits, this kit can be suitable for effective detection of the covid-19 virus.