رابطه بین غلظت کلسیم داخل سلولی و تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن در اسپرماتوزوای تازه و منجمد ذوب شده انسان

زمینه و هدف: نگهداری اسپرم‌ها به صورت منجمد در نیتروژن مایع یک روش پرکاربرد برای حفظ طولانی مدت آن‌ها است. بسیاری از این اسپرم‌ها پس از ذوب شدن، آسیب دیده و زنده نمی‌مانند و بسیاری نیز قدرت تحرک خود را از دست می‌دهند. این آسیب‌ها ناشی از آسیب به غشا اسپرم و تغییر نفوذپذیری به یون‌ها به خاطر تغییرات فشار اسمزی، تشکیل کریستال‌های یخ و افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن است. هدف از این مطالعه تعیین رابطه بین غلظت کلسیم داخل سلولی و تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن در اسپرماتوزوای تازه و منجمد ذوب شده انسان بود. روش بررسی: در این مطالعه نیمه تجربی که در سال 1392 انجام شد، تعداد 35 نمونه سیمن انسان بارور به طور تصادفی انتخاب و به دو گروه تازه و منجمد ذوب شده تقسیم شدند. اسپرم‌های گروه دوم به روش‌های استاندارد انجماد برای یک ماه در نیتروژن مایع نگهداری شدند. اسپرم‌های تازه و اسپرم‌های منجمد، پس از ذوب شدن در معرض 10 میکرومولار اینوفور کلسیم (a23187) قرار گرفتند. میزان تحرک، بقا و وضعیت آکروزوم در هر دو گروه در شروع آزمایش و بعد از قرار گرفتن در معرض اینوفور کلسیم بررسی شد. محتوای کلسیم داخل سلول، با روش فلوسیتومتری و استفاده از رنگ فلوروسنت flou3/am و میزان تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن با استفاده از لومینول و با روش کمی ‌لومینیسنس ارزیابی شد. داده‌های جمع‌آوری شده با آزمون‌های من‌ ویتنی و پیرسون تجزیه و تحلیل شدند. یافته‌ها: درصد کل اسپرم‌های زنده، متحرک و پیشرونده و درصد اسپرم‌های با آکروزوم سالم پس از پروسه انجماد ذوب به طور معنی‌داری کاهش یافت. افزودن a23187 به محیط سبب افزایش کلسیم داخل سلولی اسپرم‌های زنده شد، اما درصد اسپرم‌های زنده و متحرک هر دو گروه را کم کرد. تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن را به ازای سلول‌های زنده در هر دو گروه بیشتر کرد، ولی این افزایش در گروه منجمد ذوب شده به طور معنی‌داری از گروه تازه بیشتر بود(p<0.001). نتایج وجود یک رابطه مثبت معنی‌دار بین کلسیم داخل سلولی و تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن را نشان داد. نتیجه‌گیری: یون کلسیم برای عملکرد طبیعی اسپرم لازم است، اما افزایش ورود کلسیم به وسیله a23187 به اسپرم‌های تازه یا منجمد ذوب شده، سبب آسیب بیشتر و کاهش حرکت و بقا می‌شود. میزان رادیکال‌های آزاد اکسیژن رابطه مستقیم و معنی‌داری با کلسیم داخل سلولی دارد. آسیب‌های ناشی از انجماد با مقادیر زیادتر کلسیم داخل سلولی تشدید می‌شوند و این مسئله ممکن است به خاطر افزایش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن باشد.

The Relation between Intracellular Calcium Concentration and Reactive Oxygen Species Production in Fresh and Cryopreserved-Thawed Human Spermatozoa

Background aim: Storing frozen sperm in liquid nitrogen is a widely used method of preserving them for a long time. Many of these sperms are not damaged or survive after thawing, and many lose their motility. These injuries are caused by damage to the sperm membrane and changes in permeability to ions due to changes in osmotic pressure, the formation of ice crystals, and increased production of oxygen free radicals. The aim of the present study was to determine the relationship between intracellular calcium concentration and the production of oxygen free radicals in fresh and frozen humanthawed spermatozoa. Methods: In this quasiexperimental study conducted in 2013, 35 samples of fertile human cement were randomly selected and divided into two groups: fresh and frozenthawed. The sperm of the frozenthawed group were preserved under liquid nitrogen for one month. The effect of 10 micro;M calcium ionophore A23187 was evaluated on fresh and thawed sperm motility, viability, and acrosome reaction. Oxygen free radical production and intracellular calcium content were evaluated using luminol and Flou3/AM staining by chemiluminescence and flowcytometric method, respectively. Data were compared using the Mann -Whitney test. P<0.05 was considered statistically significant. Results: The percentage of alive, motile and progressive sperm and the percentage of sperm with intact acrosome decreased significantly after the freezingthawing process. The addition of A23187 to the medium increased intracellular calcium in live sperm but decreased the percentage of live and motile sperm in both groups. The production of free radicals increased per live cell in both groups, but this increase was significantly higher in the frozenthawed group than in the fresh group. The results indicated a significant positive relationship between intracellular calcium and the production of oxygen free radicals. Conclusion: Calcium ions were required for normal sperm function, but increased calcium entry by A23187 into fresh or frozenthawed sperm causes more damage and reduced motility and survival. The amount of oxygen free radicals had a direct and significant relationship with intracellular calcium. Freezing damage was exacerbated by higher levels of intracellular calcium, which may be due to increased production of oxygen free radicals.