تشخیص اتصال پپتید ضد رگ‌زایی به سلول‌های huvec با استفاده از fitc

زمینه و هدف: رگ‌زایی تولید عروق خونی جدید از عروق موجود است. رگ زایی وابسته به وجود تعادل بین فاکتورهای فعال کننده و مهار کننده آن است. اندواستاتین، یک قطعه 20 کیلو دالتونی از کلاژن xviii و عضوی از گروه پروتئین های مهار کننده رگ زایی می باشد که تکثیر و مهاجرت سلول‌های اندوتلیال و تشکیل ساختار لوله مانند را مهار می کند. استفاده از روش های رنگ سنجی به واسطه پروب های فلورسنت به عنوان ردیاب، کاربرد گسترده‌ای دارد، لذا هدف از این مطالعه تعیین و تشخیص اتصال پپتید ضد رگ‌زایی به سلول‌های اندوتلیای بند ناف انسانی با استفاده از یک نشانگر فلورسنس بود. روش بررسی: در این مطالعه تجربی قطعه 27 آمینواسیدی مربوط به دمین انتهای آمینوی پروتئین اندواستاتین، با fitc به عنوان یک نشانگر فلورسنس، نشانه‌گذاری شد. از روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون به وسیله سفادکس g10 برای جداسازی پپتیدهای اتصال یافته استفاده شد و در نهایت به منظور تایید اتصال fitc به پتید از روش ftir استفاده شد. سلول‌های اندوتلیال بندناف انسانی بعد از کشت با پپتیدهای اتصال یافته به نشانگر تیمار شدند و با استفاده از میکروسکپ فلورسانس به منظور مشاهده اتصال پپتید به رسپتور خود بر روی سطح این سلول‌ها مطالعه گردید. یافته‌ها: نتایج این مطالعه با میکروسکوپ فلورسانس اتصال این پتید ضد رگ‌زایی به گیرنده مخصوص خود بر روی سلول‌های اندوتلیال را تایید می‌کند. جهت رسیدن به شرایط مناسب برای نشانه‌گذاری پپتیدها، شرایط مختلف آزمایشی از قبیل غلظت پپتید و fitc و زمان و دمای انکوبه شدن مورد بررسی قرار گرفت. fitcهای آزاد به وسیله روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون از نمونه‌های کانژوگه fitcpeptideجدا شدند. سلول‌های اندوتلیال بند ناف انسانی (huvec) کشت داده شده با نمونه‌های کانژوگه fitcpeptide تیمار شد. سپس سلول‌ها تثبیت و به وسیله میکروسکوپ فلوئورسانس مطالعه شدند. نتیجه‌گیری: در این تحقیق اتصال بین fitc، به عنوان یک پروب فلورسانس به پپتید در یک شرایط بهینه انجام شد. به علاوه نشان دادیم که این کمپلکس قابل جداسازی می‌باشد. از طرفی نتایج تحقیقات حاکی از این است که پپتید مشتق از اندواستاتین به نحو موثری به سلول‌های huvec متصل شده است. این روش راهکار درستی برای شناسایی این اتصال می‌باشد. اتصال پروب فلورسنت به پپتید می‌تواند به عنوان یک ابزار مولکولی مناسب برای مطالعات آینده در دو حوزه in vitro و in vivoاستفاده شود.

Diagnosis of Anti-Angiogenesis Peptide Binding to HUVECs Using FITC

Background aim: Angiogenesis is the production of new blood vessels from existing vessels. Angiogenesis depends on the balance between its activating and inhibitory factors. Endostatin, a 20kDa fragment of collagen XVIII, is a member of the angiogenesis inhibitory protein group that inhibits endothelial cell proliferation and migration and tubularlike structure. The use of colorimetric methods by fluorescent probes as a tracer is widespread, so the aim of this study was to determine and detect the binding of antiangiogenic peptide to human cord endothelial cells using a fluorescence marker. Methods: In the present experimental study, the 27 amino acid fragment of the endostatin protein amino acid domain was labeled with FITC as a fluorescence marker. Gel filtration chromatography with Sephadex G10 was used to separate the bound peptides and finally FTIR method was used to confirm the binding of FITC to the peptide. Human umbilical cord endothelial cells were treated with markerbound peptides after culturing and studied by fluorescence microscopy to observe peptide binding to their receptor on the surface of these cells. Results: findings by Fluorescence microscopy confirmed binding antiangiogenic peptide to its specific receptor. Various conditions such as concentration, time, and temperature were tested to achieve the proper conditions for marking peptides. Unlabeled FITCs separated by gel filtration Chromatography method with sephedex G10. Human umbilical endothelial cells (HUVECs) are harvested and treated with conjugate samples (FITCpeptide) from gel filtration chromatography. After the required time, the cells were fixed and the binding of labeled peptides to their receptors on HUVECs was analyzed by Fluorescence microscope. Conclusion: The results of fluorescence microscopy confirmed the binding of this antiangiogenic peptide to its specific receptor on endothelial cells. Different experimental conditions such as peptide concentration and FITC and incubation time and temperature were studied to obtain the appropriate conditions for peptide labeling. Free FITCs were separated by conjugated FITCpeptide samples by gel filtration chromatography. Human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) cultured with FITCpeptide conjugated samples were treated. The cells were then fixed and examined by fluorescence microscopy.