تهیه آنتی سرم اختصاصی (mono specific) برعلیه آنتی ژن o و h سالمونلا جهت استفاده در کیت های تشخیصی آگلوتیناسیون و الایزا

مقدمه: عفونت سالمونلا (سالمونلوزیس) یکی از شایع ترین عفونت ها بوده که بر دیواره روده اثر می گذارد. برای شناسایی این باکتری از روش های مختلفی از قبیل pcr، multiplex pcr، الایزا و آگلوتیناسیون استفاده می شود. با اینحال معمولاً روش های تشخیصی سریع، مقرون به صرفه و آسان مانند تست آگلوتیناسیون توصیه می گردد. در ایران آنتی سرمی که به عنوان کنترل مثبت در کیت های تشخیصی ویدال بکار می رود به صورت پلی والان بوده و بر علیه هر دو آنتی ژن o و h واکنش می دهد. هدف از این تحقیق تولید آنتی سرم اختصاصی (mono specific) بر علیه آنتی ژن های o و h برای استفاده در کیت های مختلف از قبیل آگلوتیناسیون و غیره می باشد.روش کار: سوسپانسیون باکتری غیرفعال شدۀ dh و do (استاندارد 3 مک فارلند)، به صورت داخل وریدی به خرگوش سفید نیوزلندی تزریق گردید. یک هفته بعد از آخرین تزریق، خونگیری و جمع آوری سرم انجام پذیرفت. تست جذب، انکوباسیون با آنتی ژن h و o در 37 درجۀ سانتی گراد به مدت دو ساعت انجام شد و پس از سانتریفوژ، مایع رویی که حاوی آنتی سرم اختصاصی (mono specific) بر علیه آنتی ژن های o و h بود جمع آوری گردید. همچنین جهت استفاده از این آنتی سرم های mono specific، در تست های اختصاصی مانند الایزا، ایمونوفلئورسانس و غیره، تخلیص آنتی بادی با استفاده از روش های مختلف از قبیل رسوب با آمونیم سولفات، تانژنشیال فلوفیلتریشن و کروماتوگرافی انجام شد. مطالعه حاضر با کد اخلاق ir.pii.rec.1399.006 در شورای پژوهشی انستیتو پاستور ایران تصویب شده است.یافته‌ها: یافته های حاصل از تست آگلوتیناسیون قبل و بعد از جذب، نشان دهنده واکنش متقاطع قبل از جذب و عدم واکنش متقاطع با آنتی ژن h و o بترتیب با آنتی سرم های مونواسپسیفیک بر علیه o و h بعد از جذب می باشد. نتایج حاصل نشانگر این است که آنتی سرم خالص سازی شده هم از لحاظ کمیت (غلظت بالا) و کیفیت (خلوص بالا) از درجۀ مناسبی برخوردار می باشد.نتیجه گیری: تشخیص سریع بیماری به وسیله آزمایش های مختلف مانند تستهای سرمی که دارای حساسیت، اختصاصیت و سرعت عمل بالا و هزینه کمتری هستند، توصیه میشود. بنابراین با استفاده از آنتی سرم های اختصاصی تولید شده در این تحقیق، برای غربالگری اولیۀ عفونت های سالمونلا، می توان از آنها در تست های مبتنی بر آگلوتیناسیون که سریع، مقرون به صرفه و آسان می باشند استفاده نمود. همچنین با توجه به درجه خلوص بالای به دست آمده، این آنتی سرم ها در تستهای مختلف، از قبیل الایزا و ایمونوفلئورسانس کاربرد دارند.

preparation of mono specific antiserum against salmonella o and h antigens for application in agglutination and elisa tests

introduction: salmonella infection (salmonellosis) is a common bacterial disease that affects the intestinal tract. several methods like multiplex or real-time pcr, elisa, and agglutination are used to identify these bacteria. however, normally rapid, cost effective and easy diagnostic methods such as agglutination test is recommended. in iran, positive control antiserums used in diagnostic kits work based on polyvalent agglutination and are against o and h antigens. the purpose of this research was to produce specific anti-sera against o and h antigens for using in agglutination and elisa kits.methods: new zealand white rabbits were immunized by intravenous injections of inactivated bacterial o and h antigens adjusted to a cell density equivalent to a turbidity of a mcfarland number 3 standard. serum collection was performed 7 days after the last injection. collected antisera were tested with positive human specimens as well as cross-reaction antibodies. absorption method was used to obtain specific anti-sera against o and h antigens. produced anti-o and anti-h antibodies were mixed with bacterial h and o antigens respectively and incubated for 1 hours in 37˚c. the mixture was centrifuged and the supernatant was collected. furthermore, in order to use these antisera in specific kits such as elisa, immunofluorescence etc., purification methods like ammonium sulphate precipitation, tangential flow filtration and chromatography were performed. this study was approved by the ethics committee of pasteur institute of iran (code: ir.pii.rec.1399.006).results: results of agglutination test before and after adsorption showed cross-reaction before adsorption and no cross-reaction with h and o antigens with monospecific antisera against o and h after adsorption, respectively. moreover, high quality and quantity of mono-specific antibody was obtained after purification.conclusions: serum-based assays are recommended for the timely diagnosis of the disease since these assays are specific, sensitive, inexpensive, and rapid. therefore, the produced antiserum in the present research can be used in primary screening of salmonella infections based on agglutination tests which are cost effective and simple. in addition, purified anti-sera can be used in the development of elisa and immunofluorescence assays.