بهینه‌سازی وکتور بیانی pet جهت فیوژن‌کردن پروتئین نوترکیب و بیوپلیمر پلی‌پپتید شبه‌الاستین

زمینه و هدف تکنیک dna نوترکیب، یک روش قدرتمند و مناسب برای تولید بیوپلیمرهای پروتئینی با اختصاصیت در توالی آمینواسید و شیمی فضایی است. پلی‌پپتید شبه‌الاستین بیوپلیمری زیست‌سازگار، زیست‌تخریب‌پذیر و غیرایمونولوژیک است که در مطالعات گوناگون بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار می‌گیرد. تگ elp یک تکنیک ارزان، سریع و غیرکروماتوگرافی برای تخلیص پروتئین‌های هدف است. در این مطالعه وکتور بیانی petmod جهت کنار هم قرارگیری توالی ژن‌های elp و پروتئین نوترکیب هدف، به منظور تولید پروتئین فیوژن نوترکیب به همراه تگ elp طراحی و ساخته شدند. مواد و روش ها ژن mod پس از طراحی و سنتز در بین سایت برش xbai و xhoi موجود در وکتور pet32a (+) کلون، و به سلول‌های (e.colibl21(de3 ترانسفرم شد. سپس، کلنی‌ها بر اساس اندازه پلاسمید جداسازی و به وسیله برش توسط آنزیم‌های با اثر محدود، بررسی شد. تایید نهایی کلنی‌های نوترکیبب با استفاده از pcr و توالی‌یابی (dna (dna sequencing انجام گرفت.ملاحظات اخلاقی این مطالعه در کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی اراک با کد 1114692 تصویب شد.یافته ها جایگزینی توالی mod در وکتور pet32a (+) باعث حذف قطعات بیان‌کننده تگ‌های فیوژن (thioredoxin:trx histidine:his ،stag)، سایت شناسایی هضم آنزیمی پروتئاز (tev) و جایگاه کلونینگ چندگانه و اضافه‌کردن توالی‌های شناسایی آنزیم با اثر محدود اختصاصی ژن elp و ژن هدف شد. درنتیجه در وکتور بهینه‌شده petmod کاهش 466 نوکلئوتید در سایز و بهبود ساختار ثانویه حاصل شد.نتیجه گیری با توجه به بهبود ساختار فضایی و کاهش اندازه وکتور petmod، و نیز امکان فیوژن‌کردن پروتئین نوترکیب با تگ elp‌، امکان استفاده اختصاصی از این وکتور به منظور elpyation پروتئین هدف وجود دارد.

Optimization of PET Expression Vector for Fusion of Recombinant Protein and Elastin-Like Polypeptide Biopolymer

Background and Aim recombinant DNA technique is a powerful and appropriate method for the production of protein biopolymers with specificity in amino acid sequence and spatial chemistry. ElastinLike Polypeptide (ELP) is a biocompatible, biodegradable and nonimmunological biopolymer used in various biotechnology studies. The ELP tag is a cheap, fast and nonchromatographic technique for purifying target proteins. In this study, pET expression vector was designed for the combination of ELP gene sequences and target recombinant protein in order to produce recombinant fusion protein with the ELP tag.Methods Materials MOD gene was transformed to E. coliBL21 (DE3) cells after designing and synthesis among the XbaI and XhoI restriction sites in the pET32a (+) vector of the clone. Then, colonies were isolated based on plasmid size and examined by cutting using restriction enzymes. The final recombinant colonies was verified using polymerase chain reaction method and DNA sequencing.Ethical Considerations The Research Ethics Committee of Arak University of Medical Sciences approved all ethical considerations ofworking on laboratory animals (Code: 9214611).Results Replacing the MOD sequence in the pET32a vector (+) eliminated the components expressing the fusion tags (Thioredoxin, Histidine, and Stag), the identification site of protease enzyme (tobacco etch virus), and multiple cloning site. In addition, it added specific restriction enzyme identification sequences of ELP gene and target gene. As a result, in the optimized pETMODvector, 466 nucleotides reduced in size and the secondary structure was improved.Conclusion Considering the improvement of spatial structure and reduction of pETMOD vector size, as well as the possibility of the fusion of recombinant protein with the ELP tag, it is possible to use this vector for ELPyation of the target protein.