طراحی، ساخت، بیان و تخلیص ژن کدکننده پروتئین کایمر cfae, cotd از باکتری enterotoxigenic escherichia coli

زمینه و هدف: اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (etec) یکی از رایج ترین علل باکتریایی مرگ و میر ناشی از اسهال در کودکان و مسافران کشورهای در حال توسعه می باشد. فاکتورهای کلونیزاسیون etec مانند cfa / i و cs2 نقش مهمی در ایجاد بیماری دارند. در این مطالعه برای ساخت پروتئین نوترکیب از همجوش زیرواحد راسی cfa / i (cfae) و زیر واحد ساختاری cs2 (cotd) از etec استفاده شده است. از آن جایی که پاسخ های ایمنی مخاطی روده علیه cf ها می تواند مانع از ایجاد بیماری شود، مطالعه حاضر با هدف تولید آنتی ژن کایمریک به جهت ساخت واکسن موثر علیه باکتری etec انجام شد.مواد و روش ها: به منظور تکثیر ژن cfae-cotd، از ساختار ژنی دوگانه متشکل از cfae و cotd، واکنش pcr توسط پرایمرهای طراحی شده انجام شد. ژن تکثیر شده در وکتور بیانی pet28a همسانه سازی شد. در پی القای سازه ژنی نوترکیب با ماده ی iptg، پروتئین نوترکیب بیان و با ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی، خالص سازی و به وسیله وسترن بلاتینگ توسط antihistag تایید شد.ملاحظات اخلاقی: این مطالعه با کد ir.iau.srb.rec.1397.066 در کمیته اخلاق پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران به تصویب رسیده است. یافته ها: صحت همسانه سازی با استفاده از کلونی pcr و واکنش هضم آنزیمی تایید شد. حضور باند در ژل sdspage 10% در محدوده ی 68 کیلو دالتونی، بیان پروتئین نوترکیب و هم چنین حضور باند بر کاغذ نیتروسلولز در محدوده مذکور در آزمون وسترن بلاتینگ، تاییدی بر تولید پروتئین نوترکیب بود.نتیجه گیری: بهینه سازی کدون و بیان در میزبان های هترولوگ یک روش مفید در تولید پروتئین های نوترکیب است. هم چنین تولید آنتی ژن های etec به عنوان کاندید واکسیناسیون بر علیه این باکتری مطرح می باشد.

Design, Construction, Expression and Purification of the Gene Encoding Chimeric Cfae, Cotd Protein, from Enterotoxigenic Escherichia Coli

Background and Aim: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is one of the most common bacterial causes of diarrhea deaths among children and travelers in developing countries. The ETEC colonization factors, such as CFA/I and CS2 play an important role in the development of the disease. In this study, to produce the CFaE fusion recombinant protein, the tip subunits CFA/I(CfaE) and sub structural unit of CS2 (CotD) from ETEC, were used. Since mucosal immune responses to CFs can prevent disease, the aim of this study was to develop a chimeric antigen for developing the effective vaccine.Materials and Methods: In order to amplify the cfaecotd gene, a dual gene construct consisting of cfae and cotd, the PCR reaction was performed by designed primers. The propagated gene was cloned in the expression vector pET28a. Following the induction of a recombinant gene construct with IPTG, the recombinant protein was expressed and purified by NiNTA chromatography column and confirmed by western blotting by AntiHistag.Ethical Considerations: This study with research ethics code IR.IAU.SRB.REC.1397.066 has been approved by research ethics committee at Islamic Azad University, Science and Research Branch of Tehran, Iran.Findings: Cloning accuracy was confirmed by PCR and enzyme digestion reaction. The presence of the band in the SDSPAGE 10% gel in the 68 kDa region, the expression of the recombinant protein, and the presence of the band on the nitrocellulose paper in the Western blotting test confirmed the production of recombinant protein.Conclusion: Optimization of codon and expression in heterologous hosts is a useful method for the production of recombinant proteins. The production of ETEC antigens as a candidate for vaccination against this bacterium is also prominent.