تشخیص مولکولی paecilomyces formosus در جنگل های زاگرس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی

شناسایی دقیق گونه‌های میزبان برای تشخیص بیماری و اتخاذ استراتژی صحیح مدیریت آن بسیار مهم است. گونه paecilomyces formosus، عامل سرخشکیدگی و زوال بلوط، تهدیدی نوظهور است که ممکن است در آینده جنگل‌های زاگرس ایران را در معرض خطر جدی قرار دهد. در این مطالعه از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تودرتو با جفت‌ آغازگرهای اختصاصی pamf و pamr طراحی شده از مقایسه توالی‌های نوکلئوتیدی ناحیه نسخه برداری شده داخلی dna ریبوزومی هسته‌ای (its) گونه p. formosus و سایر آرایه‌های نزدیک، برای تشخیص این گونه استفاده شد. برای این منظور نمونه‌برداری از درختان جنگلی با علائم سرخشکیدگی در دو استان کرمانشاه و ایلام صورت گرفت. جدایه‌های paecilomyces با استفاده از ویژگی‌های ریخت‌شناختی، تولید اسید روی محیط کشت کراتین سوکروز آگار و توالی‌یابی ناحیه its rdna و قسمتی از ژن بتاتوبولین شناسایی گردیدند.  با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تودرتو، باند 441 جفت بازی منحصراً از dna ژنومی p. formosus تکثیر شد و هیچ باندی برای سایر گونه‌ها و از جمله گونه p. variotii مشاهده نشد. روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تودرتو می‌تواند 100 پیکوگرم از dna ژنومی p. formosus را ردیابی کند. شصت درخت از هفت منطقه درجنگل‌های زاگرس با علائم سرخشکیدگی مورد ارزیابی قرار گرفت که گونه‌های گیاهی کرف (acer sp.)، بلوط لبنانی (quercus libani)، کیکم (کرکو) (acer monspessulanum)، کنار (ziziphus spina christi)، انجیر  (ficus carica)، پلت (acer sp.)، تِنْگِس (amygdalus lycioides)، گز (tamarix ramosissima)، آلبالوی وحشی(cerasus microcarpa)  و گیلاس وحشی (cerasus avium)  برای اولین بار به‌عنوان میزبان‌های جدید برای p. formosus گزارش می‌شوند. تائید بیماریزایی جدایه‌ها با مایه زنی روی شاخه‌های بریده و شاخه‌های سالم درختان انجام شد. آغازگرهای اختصاصی طراحی شده در این تحقیق می‌تواند برای ردیابی سریع و مطمئن p. formosus، پایش همه‌گیری‌‌ها و اتخاذ استراتژی‌های صحیح مدیریتی در جنگل‌های زاگرس مورد استفاده قرار گیرد.

molecular diagnostics of paecilomyces formosus in zagros forests using species specific primers

accurate identification of the host species is critically important for disease detection and informing appropriate disease management decisions. paecilomyces formosus, a causal agent of dieback and decline of oak, is an emerging threat that may cause severe risk to the zagros forests of iran in the future. in this study, a nested pcr assay for the identification of p. formosus was developed with the species specific primer pairs pamf and pamr designed from the comparisons of nucleotide sequences of the nuclear ribosomal dna internal transcribed space regions (its) from p. formosus isolates and other closely related taxa. to accomplish this, we sampled forest trees with dieback symptoms in kermanshah and ilam provinces. the paecilomyces isolates were identified based on morphological characteristics, acid production on keratin sucrose agar medium, and sequencing of the its rdna region and part of the beta tubulin gene. nested pcr was successfully amplified a 441 bp product exclusively from p. formosus genomic dna, and no cross reactions were observed with any other species, and also p. variotii. the nested pcr method can detect 100 fg of p. formosus genomic dna. sixty of symptomatic forest trees from seven locations in zagros foreste were assayed, resulting in the discovery of amygdalus lycioides, cerasus avium, cerasus microcarpa, quercus libani, acer spp., acer monspessulanum, ficus carica, ziziphus spina christi, tamarix ramosissima and ziziphus spina christi as new host species, and all seven infested areas. to fulfill koch’s postulates, the experiments were carried out on detached branches and attached healthy branches of trees at the forests in kermanshah and ilam provinces, iran. the pcr based method developed here can be used for a fast and reliable diagnosis of p. formosus, monitoring the epidemics, and assessing management strategies in zagros forests.