شناسایی مولکولی، بررسی تبارزایی و تنوع ژنتیکی ویروس موزاییک شلغم در مزارع کلزا استان ‏خراسان جنوبی

کلزا با نام علمی (brassica napus) یکی از اعضای خانواده  brassicaceae(خردل یا خانواده کلم) با گل‌های زردرنگ می‌باشد، که عمدتاً به دلیل داشتن دانه‌های غنی از روغن کشت می‌شود. ویروس موزاییک شلغم (turnip mosaic virus) از شایع‌ترین و مهم‌ترین بیماری‌های ویروسی کلزا در دنیا به‌شمار می‌آید. در فروردین و اردیبهشت‌ماه 1397، به‌منظور شناسایی مولکولی ویروس‌های جنس potyvirus، تعداد 66 نمونه برگی از شهرستان‌های سرایان، فردوس، سه قلعه و آیسک در استان خراسان جنوبی جمع‌آوری شد. این نمونه‌ها دارای علائم مشکوک ویروسی نظیر زردی، کوتولگی، موزاییک، چروکیدگی برگی بودند. برای شناسایی ویروس، آر. ‌ان. ‌ای کل، با استفاده از کیت شرکت دنازیست استخراج و دی. ‌ان. ‌ای مکمل از روی آر. ‌ان. ‌ای ویروسی ساخته شد. سپس با استفاده از یک جفت آغازگر دژنره مربوط به جنس پتی ویروس به نام cir/cif  که منطبق بر قسمتی از ناحیه ژن کدکننده پروتئین ci بود، قطعه‌ای به طول 680 جفت باز در 12 نمونه کلزا تکثیر و تعیین توالی شد که شباهت بالایی به ویروس موزاییک شلغم داشت. سپس این نمونه‌ها، با آغازگر اختصاصی ژن پروتئین پوششی ویروس موزاییک شلغم (tumvf/tumvr)، آزمایش شدند، که نهایتا منجر به تکثیر قطعه ای به طول 980 جفت باز در هشت نمونه گردید. نتایج تعیین توالی نشان داد که هشت نمونه گیاهی کلزا به ویروس tumv آلوده می‌باشند. در نهایت شش نمونه که خوانش آنها به صورت کامل انجام شده بود، در بررسی‌های تبارزایی بر مبنای توالی پروتئین پوششی مورد استفاده قرار گرفت. بررسی‌های نوترکیبی نشان از وجود دو نمونه نوترکیب داشت که از بررسی تبارزایی حذف شد. چهار جدایه‌ ایرانی غیر نوترکیب در گروه  asian brو در مجاورت سایر جدایه‌های آسیا قرار گرفتند. تشابه توالی نوکلئوتیدی در ناحیه پروتئین پوششی در بین گونه‌های این تحقیق 9590 درصد تعیین گردید. بررسی‌های نوترکیبی نشان داد که در دو جدایه ویروس موزاییک شلغم مطالعه‌شده در این تحقیق به نام‌های cse55 و cse39 نوترکیبی محتمل است. همچنین بررسی‌های تنوع نوکلئوتیدی جدایه‌ها بانرم افزار  dnaspو منفی بودن آزمون آماری tajima’s d به این معنی است که انتخاب در جهت متنوع شدن و بزرگ شدن جمعیت رخ داده است. تحقیق حاضر اولین گزارش از وقوع این ویروس در مزارع کلزا استان خراسان جنوبی و اولین بررسی مولکولی و تبارزایی جدایه‌های ویروس مذکور در مزارع کلزا می‌باشد.

Molecular characterization, phylogenetic analysis and nucleotide diversity of Turnip ‎mosaic virus in canola fields of south Khorasan

Canola (Brassica napus) is one of the most important members of Brassicaceae family and Turnip mosaic virus is one of the most widespread viruses in canola fields all around the world. During May and April of 2018, 66 canola samples were collected from different regions of south Khorasan Province. The samples showed symptoms such as yellowing, stunning, mosaic and leaf distortion. Total RNA of samples was extracted by Dena Zist kit (Iran) and then DNA complementary was made by reverse primer. RTPCR is done using specific primers of TuMV. A fragment with 680 bp length was amplified and sequenced in 12 canola samples that had high similarity to TuMV. Therefore, positive samples used in RTPCR by specific primers of TuMV related to coat protein coding regions. Finally eight amplified fragments with 980 bp length were sequenced and then analyzed by Blast, MegaX, SDTv and DnaSPs softwares. Results showed that six samples of canola were infected by TuMV. Consequently, phylogenetic analysis of four non recombinant isolates that are sequenced perfectly used in the phylogeny analysis and results showed that Iranian isolates in this study located in Asian BR phylogeny group included other Asian isolates. Nucleotide similarity between Iranian isolates ranged from 90 to 95%. Recombination analysis using RDP4 showed that two Iranian isolates (CSe55, CSe39) are recombinant and are evolved from minor and major parents. Nucleotide diversity by DnaSP showed that population of TuMV is developing in this part of Iran. This survey is the first report of TuMV in south khorasan and molecular investigation of TuMV in Canola field.