شناسایی مولکولی باکتری‌های مولد گال در درختان میوه هسته‌دار و دانه‌دار با استفاده از توالی ژن reca

بیماری گال طوقه یکی از بیماری های مهم از لحاظ اقتصادی در انواع گیاهان باغی، زراعی و زینتی محسوب می‌شود. باکتریagrobacterium tumefaciens ، عامل بیماری است که می تواند به صورت غیرفعال در خاک و به صورت فعال در گیاه میزبان بقاء یابد. در این مطالعه، از توالی ژن reca جهت ارزیابی کارآیی آن در شناسایی و تبارشناسی جدایه های گال زای دو گونه agrobacterium tumefaciens و agrobacterium rubi استفاده شد. جدایه های بیماری زای این مطالعه، از گال های ایجاد شده روی شاخه های درختان گیلاس، آلو و سیب در باغات ارومیه، نقده، سردشت و خوی واقع در استان آذربایجان غربی جداسازی شدند. شناسایی فنوتیپی جدایه ها و آزمون بیماری زایی با تشکیل گال روی طوقه گوجه فرنگی در مطالعات قبلی انجام شده بود. پس از استخراج dna، واکنش زنجیره ای پلی مراز با استفاده از آغازگرهای 91f/595r جهت تکثیر ژن reca انجام شد. قطعه 462 جفت بازی در همه جدایه های باکتریایی تکثیر شد. مقایسه توالی ژن reca در جدایه های باکتری، شباهت 99.95 تا 100 درصد را با توالی های سویه های مرجع باکتری a. tumefaciens ثبت شده در بانک ژن نشان داد. در درخت تبارزایی، از توالی ژن reca جدایه های این مطالعه و سویه های مرجع a. tumefaciens و a. rubi استفاده شد. درخت تبارزایی شامل دو شاخه اصلی بود. جدایه های این مطالعه به همراه سویه های مرجع a. tumefaciens از کشورهای مختلف در شاخه اول که خود شامل دو زیرشاخه بود، قرار گرفتند. در شاخه دوم، سویه ای از باکتری a. rubi مجزا از جدایه های a. tumefaciens قرار گرفت. نتایج درخت تبارزایی نشان داد که این ژن، کارآیی کافی در تفکیک باکتری های a. tumefaciens و a. rubi را دارد، به طوری که سویه های باکتری a. rubi در شاخه ای مجزا از سویه های a. tumefaciens قرار گرفتند. با توجه به این نتایج، پیشنهاد می شود که در شناسایی و بررسی روابط تبارشناسی گونه های جنس agrobacterium، از توالی ژن خانه داری reca استفاده شود تا نتایج دقیق تری از موقعیت آرایه های این باکتری ها به دست آید.

molecular identification of gall-forming bacteria in stone and pome fruits using the reca gene sequence

introductioncrown gall is an economically important plant disease that affects dicotyledonous and a few monocotyledonous plants in orchards, farms, and nurseries, worldwide. the disease is caused by agrobacterium tumefaciens (smith townsend, 1907) conn 1942, a gram-negative bacterium from the family of rhizobiaceae in the class of alphproteobacteria. this bacterium can survive in the soil as well as within host plants. the key characteristic of this bacterium is its ability to transform regular plant cells into tumor cells. once this transformation is complete, the cells can continue to grow and divide independently of the bacterium. molecular methods play a key role in the identification, classification and taxonomy of prokaryotes. housekeeping genes are highly conserved protein-coding genes used to distinguish between different taxa of bacteria. in this study, the reca gene sequence was used to evaluate the efficiency of this gene in identifying and determining the phylogenetic relationships of tumor-forming agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rubi (hildebrand, 1940) starr weiss, 1943 isolates.materials and methodsthe pathogenic isolates were isolated from tumors on the branches of cherry, plum, and apple trees in the orchards of urmia, naqadeh, sardasht, and khoy; located in west azerbaijan province of iran. in a previous study, phenotypic identification of the isolates was done, as well as the pathogenicity test with the gall formation on tomato crown. in this study, the reca gene sequence of four isolates (at-u2, at-k2, at-n25 and at-n15) was used for drawing the phylogenetic tree. after dna extraction, polymerase chain reaction (pcr) was done using 91f/595r primers. each pcr reaction was performed in a 25 µl pcr cocktail containing 12 µl of taq dna polymerase 2x master mix red (amplicon, denmark), 1 µl of each primer (10 pmol µl-1), and 1 µl of template dna (50 ng). the pcr amplification program was carried out under the following conditions; initial denaturation cycle at 94 °c (5 min), 35 cycles of denaturation at 94 °c (50 sec), annealing at 57 °c (50 sec) and extension at 72 °c (1.5 min), and a final extension at 72 °c for 10 min. the sequences of the studied isolates were compared with the sequences of the reference strains registered in the ncbi database. sequence of the reca gene of a. tumefaciens and a. rubi strains, as well as strain aol15 of agrobacterium albertimagni salmassi et al., 2002, as an outgroup strain, was obtained from genbank. phylogenetic relationships were inferred, by applying the kimura-2-parameter model. the neighbor-joining (nj) method and the adjacent method by mega 11 software were used for the phylogenetic tree and tested by bootstrap analysis with 1000 repetitions.results and discussiona 462 bp fragment was amplified in all bacterial isolates.