استفاده از توکسین تولیدی قارچ‌های مولد اسکای مو به‌عنوان روش زیست‌سنجی برای غربالگری ارقام انگور

بیماری اسکای مو یک بیماری کمپلکس و پیچیده است که علایم ایجاد شده تحت تاثیر فاکتورهای محیطی و عوامل پاتوژنیکی متفاوتی می باشد. اغلب عوامل پاتوژنیک تولید متابولیت های سمی داخل گیاه می کنند که ممکن است محرک علایم بیماری باشند. عوامل قارچی مهم اسکا شاملphaeoacremonium aleophilum (pal) ،phaeomoniella chlamydospora (pch)  وfomitiporia mediterranea (fme)  بوده که تولید متابولیت های ثانویه می کنند و احتمالاً در ایجاد علایم بیماری اسکای مو نقش مهمی دارند. پولولان یک پلی‌‌ساکارید خطی و متابولیت ثانویه مهم بوده که توسط قارچ های pa1،  pchو fme تولید می شود. در این آزمایش اثر پولولان برکاهش وزن‌کالوس پنج رقم انگور تجاری استان خراسان رضوی شامل‌کلاهداری، ترکمن 8، ترکمن 6، فخری شاهرود و کشمشی‌قوچان و همچنین تاثیر آن بر فعالیت های فیزیولوژیکی (زنده‌مانی کالوس) با استفاده از اسپکترفتومتر ارزیابی شد. این آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. هدف اصلی این تحقیق ارزیابی روشی ساده و سریع جهت غربالگری ارقام مختلف انگور به بیماری اسکا بود. برای این منظور استخراج متابولیت ثانویه اگزوپلی‌ساکارید (پولولان) از قارچ‌ها انجام و تولید کالوس پنج رقم انگور تجاری نیز با استفاده از محیط‌کشت موراشیگ و اسکوگ (ms) صورت گرفت. سپس کالوس‌ها با غلظت‌های مختلفی (15%، 30% و 45%) از پولولان مایه‌زنی شدند. همچنین تاثیر متابولیت استخراجی روی برگ‌های جداشده نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که قارچ pal میزان پولولان بیشتری تولید کرد. تمامی برگ‌های انگور جداشده علایمی به‌صورت آب‌سوختگی پهنک برگ (بین‌رگبرگ‌ها) را نشان داد و قسمت‌های آب‌سوخته نکروزه و قهوه‌ای شدند. همچنین نتایج نشان داد که توکسین پولولان اثر قابل توجهی بر کاهش وزن خشک کالوس ارقام مختلف انگور مورد آزمایش دارد. رقم انگور ترکمن 8 نسبت به سایر ارقام مورد آزمایش دارای درصد کاهش وزن کالوس کمتری بود (26%) و پس از آن ارقام کلاهداری (31%) و ترکمن 6 (40%) در گروه های بعدی قرار گرفته اند. ارقام کشمشی قوچان (48%) و فخری شاهرود (44%) بیشترین کاهش وزن خشک کالوس را در پی داشته است. مجموع اثرات متقابل رقم، توکسین و قارچ های عامل مولد اسکا نشان داد که رقم ترکمن 8 در مقابل غلظت 45% توکسین تولید شده توسط قارچpal  کمترین‌کاهش وزن کالوس به میزان 65% را نسبت به شاهد داشته است و بیشترین کاهش وزن کالوس به میزان 90% مربوط به رقم کشمشی قوچان بود. با توجه واکنش ارقام انگور نسبت به توکسین قارچ‌های مولد اسکا می‌توان نتیجه گرفت‌که رقم انگورترکمن 8 حساسیت کمتری نسبت به رقم انگور کشمشی قوچان در مقابل بیماری اسکای انگور از خود نشان خواهد داد.سلول های کالوس رام ترکمن 8 بیشترین شدت جذ نوری را داشت یعنی تعداد سلول های زنده آنها نسبت به سایر ارقام بیشتر بود.رقم کشمشی قوچان با حداقل سلول های زنده کالوس حساسیت بیشتری به توکسین نشان داد و دارای شدت جذ نوری کمتری بود.

application of the toxin produced by esca-associated fungi as a bioassay method for screening grapevine cultivars

introduction esca of grapevine (vitis vinifera) is an important complex disease in almost all areas, where grapevines are grown. the symptoms of this disease may affect the trunk, branches, shoots (brown wood-streaking and white rot of trunk), leaves (light green or chlorotic, irregular areas between the veins or along the leaf margin, which gradually spread from the basal to the distal parts of the shoot) and fruit (tiny brown spots and sometimes wilt of berries). toxins are secondary metabolites, which are important virulence factors of phytopathogenic fungi. phaeoacremonium aleophilum (pal), phaeomoniella chlamydospora (pch), and fomitiporia mediterranea (fme) produced two pentaketides (scytalone and isosclerone), and the α-glucan named pullulan. several evidences indicated that at least some of these metabolites may induce the characteristic symptoms of diseases. the main objective of this research was to establish a clear efficient and cheap method using callus and extracted toxic metabolites in order to select susceptible, tolerant, or resistant commercial grapevine cultivars to the esca disease. materials and methodsesca-associated fungi were obtained from the agricultural research, education and extension organization (areeo), khorasan razavi province, iran. five ml of a suspension of three mentioned fungi (10-day-old) in 50 ml sterile water were added to 1 l flask containing 150 ml czapek dox medium amended with 0.1% yeast and 0.1% malt extract. they were incubated at 25°c for 28 days in the dark. the mycelia were removed by filtration using filter membranes, nitrocellulose 0.22 μm. the toxic secondary metabolites were extracted from this suspension. briefly, the culture filtrates from each fungus (2 l per strain) were treated with equal volumes of cold ethanol-acetone and incubated in an ice batch for 4 to 6 hours. the resulting precipitates were extracted by centrifugation at 3000 rpm for 10 seconds. recrystallization was done by dissolving the polymer in hot water and adding the same volume of ethanol to it, and the formed precipitate was filtered through a whatman filter, dried at 40°c and weighed. the toxic metabolite obtained from liquid cultures of each fungal species was assayed on detached leaves of 5 grapevine commercial cultivars of khorasan razavi province, including torkaman8(tu8), kolahdari(kol), torkaman6(tu6), fakhri shahrood(fsh), and keshmeshi-quchan(kqu). the leaves with their petioles were immersed in a 3 ml solution until complete absorption, which usually took a few hours, and then were transferred to distilled water. callus of the five grapevine cultivars, micro propagated shoot cultures were cultivated on modified ms media containing 15, 30, and 45% toxic metabolites. the grown callus was inoculated with different concentrations of toxic metabolites,  then dry weight of callus and vital cells were measured visually, as well as spectrophotometrically, by using triphenyl tetrazolium chloride (ttc).