تخلیص پروتیین نوترکیب هماگلوتینین (ha1) ویروس آنفلوانزا سویه (a(h1n1 و تولید آنتی‌بادی پلی‌کلونال علیه آن

زمینه و هدف: سال های اخیر ویروس آنفلوانزا نوع (h1n1) a باعث عفونت های متوسط تا شدید با میزان پراکندگی وسیع در سرتاسر دنیا شده است. بنابراین تشخیص افتراقی، سریع و ارزان قیمت بر پایه شناسایی آنتی ژن ها دارای اهمیت است. همچنین تولید آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن های آنفلوانزا برای موفقیت در تحقیقات پایه و پشرفته ضروری است. هماگلوتینین مهمترین گلیکوپروتیین سطحی ویروس آنفلوانزا است که به دو زیرواحد هماگلوتینین 1 و هماگلوتینین 2 شکسته می شود. از آن جایی که بیشتر مناطق آنتی ژنی در ناحیه هماگلوتینین 1 قرار دارند، بهره گیری از این دومین به عنوان آنتی ژن، جهت تولید آنتی بادی در این پژوهش مورد مطالعه قرارگرفت.روش بررسی: پروتیین نوترکیب هماگلوتینین 1 در پژوهشی تجربی با همکاری بخش آنفلوانزا انستیتو پاستور ایران در نیمه دوم سال 1393 بیان و تخلیص شد. در ادامه آنتی بادی پلی کلونال خرگوشی علیه آن در تابستان 1394 تولید شد. پروتیین هماگلوتینین 1 آنفلوانزا (a/pr/8/34) در وکتور pet28aha1 در میزبان پروکاریتی ایشرشیاکلی bl21 در مقیاس زیاد بیان شد. با تغییر پارامترهایی مانند غلظت iptg، زمان القاء و دمای بیان، بهینه سازی بیان صورت گرفت. سپس پروتیین با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل تخلیص شد.یافته ها: تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه این پروتیین نوترکیب پس از تزریق آنتی ژن به همراه ادجوانت فروند بر اساس پروتکلی مشخص، در خرگوش انجام گرفت. همچنین کارایی سرم حاوی این آنتی بادی با استفاده از روش elisa ارزیابی شد. تعیین میزان آنتی بادی در سرم خون های جمع آوری شده از خرگوش با استفاده از الایزا مبتنی بر سرم، افزایش آنتی بادی اختصاصی را طی دوره ایمیونیزاسیون نشان داد.نتیجه گیری: با توجه به داده ها مشاهده می شود این آنتی بادی پلی کلونال ظرفیت تولید در خرگوش را داراست و می تواند در آینده در تست های تشخیص آنفلوانزا به مثابه سایر تست های ایمنی مانند وسترن بلات، ایمونوسیتوشیمی و ایمونوهیستوشیمی مورد استفاده قرار گیرد.

Purification of Influenza virus A (H1N1) recombinant Hemagglutinin (HA1) and polyclonal antibody production

Background: Each year, Human influenza A (H1N1) virus causes moderate to severe infections with a high prevalence throughout the world. Accordingly, the rapid, sensitive and costeffective laboratory diagnosis based on viral antigen detection is important. Moreover, the generation of specific antibodies directed against Influenza antigens is essential to the success of both basic and applied research programs. Hemagglutinin (HA) is the major surface envelope glycoprotein of influenza virus, which is subsequently cleaved into two subunits, HA1 and HA2. Since most antigenic sites are in the HA1 domain of HA, HA1 domain of influenza virus was studied as antigen to produce polyclonal antibody.Methods: In this experimental study we expressed and purified the recombinant HA1 protein in the second half of 2015 at department of influenza and other respiratory viruses, Pasteur Institute of Iran and then prepared the polyclonal rabbit antibody against it. The vector of pET28aHA1 expressing HA1His tagged protein of H1N1 influenza A/PR/8/34 virus was used for large scale production of HA1 into E. Coli (BL21). By changing expression conditions such as IPTG (Isopropyl beta;D1thiogalactopyranoside) concentration, time and temperature of incubation, the expression conditions for HA1 were optimized. The total cell protein harvested and purified by nickel affinity chromatography. All above mentioned experiments monitored by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE).Results: The efficiency of HA1 recombinant protein was high, equal to 400600 mg/ml of cell lysate. The polyclonal antibody was prepared by immunizing the rabbits using recombinant HA1 with Freund rsquo;s adjuvant according to standard protocols. Efficiency of the antiserum evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Determination of antibody level in the collected antiserum using serumbased ELISA showed that the specific antibody has risen well through the immunization schedule.Conclusion: Our data shows that this polyclonal antibody has potential to be produced in rabbit. It will also be used in the future in influenza diagnosis as well as in other immunological applications such as western blot analyses, immunocytochemistry, and immunohistochemistry.