اعتبارسنجی ms-pcr و تعیین پیش جهش ژن fmr1 در نارسایی زودرس تخمدان

زمینه. نارسایی زودرس تخمدان وابسته به ایکس شکننده از نظر بالینی به عنوان نوعی از نارسایی اولیه تخمدان با چرخه های قاعدگی نامنظم، افزایش سطح هورمون محرک فولیکول، یائسگی زودرس و ناباروری تعریف شده است. از نظر ژنتیکی عامل آن پیش جهش تکرار cgg ناحیه 5'-ترجمه نشده ژن fmr1 می باشد. هدف این مطالعه استاندارد سازی روش های مولکولی و مقایسه تعداد تکرار cgg ژن fmr1 در بیماران نارسایی زودرس تخمدان بود. روش کار. پس از اخذ رضایت و خونگیری، dna ژنومی استخراج و به دو روش دستی و کیت با سدیم بی سولفیت تیمار شد. با استفاده از دو جفت پرایمر اختصاصی، dna متیله شده و dna غیرمتیله با واکنش زنجیره ای پلیمراز اختصاصی متیلاسیون تکثیر و محصولات به ترتیب به ترتیب n3+ 108 و n3+ 168 جفت باز بر روی ژل آگارز آشکار شد. پس از ارزیابی­های بالینی 20 بیمار مبتلا به فرم تک­گیر و 2 خانواده با حداقل دو فرد مبتلا مورد مطالعه قرار گرفتند. یافته ها. متوسط سطح سرمی هورمون محرک فولیکول در موارد تک گیر ±ui/l 44/73 85/45 و در موارد خانوادگی ui/l 75/72± 33/61 بود. بررسی های سونوگرافیک در موارد تک­گیر و موارد خانوادگی به ترتیب 80 درصد و 75 درصد تخمدان های آتروفیک را گزارش کرد. صحت تیمار بیسولیفیت dna در هر دو روش دستی و کیت تایید شد، و تفاوتی بین دو روش مشاهده نشد. نتایج بررسی تعداد تکرارها بر روی ژل آگارز نشان داد دو بیمار در بین موارد تک گیر (10 درصد) ناقل الل اینترمدییت fmr1 بودند. هیچ موردی از پیش جهش و یا جهش کامل در موارد تک گیر یا خانوادگی مشاهده نشد، و تعداد تکرارها در آن ها بین 15 تا 35 تخمین زده شد. نتیجه گیری. به دلیل نقش ژن fmr1 در عملکرد تخمدان، بررسی آن از اهمیت برخوردار است استانداردسازی یک روش تشخیص مولکولی سریع و مقرون به صرفه از اولویت ها در این زمینه می باشد. پیامدهای عملی. تعیین تکرار cgg ناحیه 5'-ترجمه نشده ژن fmr1 و شناسایی پیش جهش هایی که ممکن است گسترش یافته و منجر به سندرم ایکس شکننده شوند در میان زنان جوان امکان مشاوره ژنتیکی لازم برای برنامه ریزی زندگی باروری را فراهم می کند.

validation of methylation-specific polymerase chain reaction method and evaluation of fmr1 gene pre-mutations in premature ovarian insufficiency

background. fragile x-associated premature ovarian insufficiency is clinically defined as a type of early ovarian failure with irregular menstrual cycles, increased follicle-stimulating hormone, premature menopause, and infertility. genetically, the cgg trinucleotide repeat expansion in the 5'-untranslated region of the fmr1 gene is recognized as a causative factor. the aim of this study was to standardize molecular detection methods and estimate the number of repeats among patients with premature ovarian insufficiency. methods. after obtaining a consent form and blood sampling, genomic dna was extracted and treated with sodium bisulfite. the fmr1 gene is located on x chromosome and one allele is methylated by x-inactivation. as a result, the methylation-specific polymerase chain reaction (ms-pcr) was performed using two pairs of specific primers for methylated and non-methylated dna yelding the products of 108+3n and 168+3n bp, respectively. following clinical evaluations, 20 sporadic patients and two families with at least two patients were studied. results. the mean level of follicle-stimulating hormone was 85.45±44.73ui/l in sporadic and 75.72±33.61ui/l in familial cases. ultrasound examinations reported atrophic ovaries in sporadic and familial cases by 80% and 75%, respectively. the evaluation of the trinucleotide repeat expansions on agarose gels showed that two sporadic patients were carriers of fmr1 intermediate alleles (10%). no cases of pre-mutation or full mutation were observed in other sporadic or familial cases and the trinucleotide repeat expansions were estimated between 15 and 35. conclusion. due to the role of the fmr1 gene trinucleotide repeat expansion in women with premature ovarian insufficiency, a fast and cost-effective molecular detection method is of particular importance. this test will be beneficial not only in ovarian dysfunction, but also to identify pre-mutations that may expand in next generations leading to fragile x syndrome. practical implications. in young women, the detection of expanded cgg trinucleotide repeats in the 5'-untranslated region of the fmr1 gene along with genetic counseling will provide them to plan reproductive life.