کلونینگ و تولید نوترکیب آنزیم گرانزیم M انسانی

زمینه و هدف: گرانزیم m یکی از اعضای خانواده‌ی سرین پروتیازهاست که درلنفوسیت‌های t سیتوتوکسیک و سلول‌های nk بیان می‌شود. گرانزیم m یک القاکننده‌ی آپوپتوز در سلول‌های توموری هدف می‌باشد. بنابراین با توجه به اهمیت گرانزیم m در آپوپتوز، هدف از این تحقیق تولید آنزیم فعال به لحاظ زیستی است.روش بررسی: قطعهcdna مربوط به گرانزیم m فعال به درون ناقل بیانی pet21a(+) کلون و ناقل نوترکیب جهت بیان پروتیین، به سلول‌های مستعد با روش شوک حرارتی منتقل گردید. جهت بیان بالای پروتیین، شرایط القا بهینه گردید و سپس آنالیز پروتیین توسطsds-page انجام گرفت. سپس انکلوژن‌بادی‌های تولیدی در بافر حاوی اوره 8 مولار حل شده و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-آگارز خالص شد. فعالیت پروتیازی گرانزیم m با استفاده از سوبسترای کازیین و با روش اسپکتروفتومتری (طیف سنجی) سنجیده شد.یافته‌ها: گرانزیم m نوترکیب در باکتری e.coli به‌صورت انکلوژن‌بادی تولید شد و بهترین سطح بیان در دمای 22 درجه‌ی با غلظت1 میلی‌مولار از iptg در طول 5 ساعت بود. با استفاده از ستون نیکل- آگارز و شیب غلظت اوره، گرانزیم m به‌طور همزمان با تاخوردن، خالص گردید. نتایج حاصل از تعیین فعالیت نشان داد که آنزیم در حضور سوبسترای کازیین فعال بوده و فعالیت ویژه‌اش 71 واحد بر میلی‌گرم است. فعال بودن گرانزیم m نشان دهنده‌ی این بود که آنزیم تاخوردگی درستی پیدا کرده است.نتیجه‌گیری: با توجه با اینکه گرانزیم m می‌تواند هدفی بالقوه برای داروهای ضد سرطان باشد، بنابراین روش پیشنهادی در این تحقیق می‌تواند تسهیل کننده مطالعه بیشتر بر روی این آنزیم باشد.واژگان کلیدی: گرانزیمm، آپوپتوز، کازیین، فعالیت پروتیازی، انکلوژن‌بادی