ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های t پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های crispr/cas9

مقدمه: ناک اوت ژنی سلول‌های t پرایمری با واسطه‌ی clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ crispr-associated protein 9 (crispr/cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب cas9 و guide rna (grna) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئینی از پیش مونتاژ شده (ribonucleoprotein یا rnp) به یک روش قدرتمند برای ویرایش ژنی بسیار کارآمد در سلول‌های t پرایمری تبدیل شده است. در این مطالعه، از سیستم انتقال مبتنی بر cas9 rnp برای ناک‌اوت هدفمند ژن‌های t cell receptor alpha constant (trac) و β2 microglobulin (b2m) در سلول‌های t پرایمری انسانی استفاده گردید.روش‌ها: بدین منظور grnaهای اختصاصی برای هدف قرار دادن اگزون‌های ابتدایی ژن‌های trac و b2m طراحی شدند. پروتئین cas9 و grnaهای سنتتیک مربوطه به طور جداگانه ترکیب شدند و به سلول‌های t پرایمری انسانی جدا شده از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (peripheral blood mononuclear cell یا pbmc) الکتروپوریت شدند. کارایی ویرایش ژنی با روش تجزیه و تحلیل tracking of indels by decomposition (tide) و فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد.یافته‌ها: سه روز پس از الکتروپوریشن سلول‌های t پرایمری با استفاده از کمپلکس‌های rnp هدف‌گیری کننده‌ی trac و b2m، آنالیز tide کارایی ناک‌اوت 60-13 درصد را برای grnaهای هدف‌گیری کننده‌ی trac و 53-21 درصد را برای grnaهای هدف‌گیری کننده‌ی b2m مشخص کرد. آنالیز فلوسایتومتری نیز به ترتیب میزان 76 و 27 درصد سرکوب کامل بیان ژن را برای کارآمدترین grnaهای هدف‌گیری کننده‌ی trac (trac-grna3) و (b2m-grna2) b2m تایید کرد.نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه، نشان می‌دهد که سیستم cas9 rnp می‌تواند به طور کارآمدی به سلول‌های t پرایمری منتقل و منجر به ناک‌اوت هدفمند ژن گردد. شیوه‌نامه‌ی شرح داده شده در این مطالعه، راهکار ساده و بسیار کارآمدی برای به حداکثر رساندن کارایی ویرایش در سلول‌های t پرایمری فراهم می‌سازد و روند ویرایش ژن برای ایمنوتراپی‌های نسل بعدی را تسهیل می‌کند.

targeted gene editing in human primary t cells using crispr/cas9 ribonucleoproteins

background: clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ crispr-associated protein 9 (crispr/cas9)-mediated gene knockout of primary t cell has several limitations for clinical applications. direct delivery of recombinant cas9 protein and synthetic grna, as a pre-assembled ribonucleoprotein (rnp) complex, has become a potent approach to introduce highly efficient gene editing in primary t cells. in this study, we employed cas9 rnp-based delivery system for targeted t cell receptor alpha constant (trac) and β2 microglobulin (b2m) genes knockout in human primary t cells.methods: specific grnas were designed to target the first exons of trac and b2m genes. cas9 protein and respective synthetic grnas were then mixed separately, and electroporated into human primary t cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (pbmcs). the gene editing efficiency was quantified using tracking of indels by decomposition (tide) analysis and flow cytometry.findings: three days after electroporation of primary t cells with the trac and b2m targeting rnp complexes, tide analysis revealed the knockout efficiency of 13-60 percent for the trac-targeting grnas and 21-53 percent for b2m-targeting grnas. flow cytometry analysis confirmed ~76% and ~27% complete loss of expression for the most efficient grnas targeting trac (trac-grna3) and b2m (b2m-grna2), respectively.conclusion: our results demonstrate that cas9 rnp system can be efficiently delivered into primary t cells and result in targeted gene knockout. the protocol described here enables a streamlined and highly efficient solution for maximizing editing efficiency in primary t cells, and simplifies the gene editing process for next-generation immunotherapies.