تولید داروی نوترکیب آسپاراژیناز باکتری e.coli در مقیاس آزمایشگاهی

مقدمه: l-asparaginase آنزیم دارویی برگرفته شده از باکتری اشرشیاکلی می‌باشد و یکی از داروهایی است که در درمان سرطان خون حاد لنفوبلاستیک به کار می‌رود. کاهش آسپاراژین خون بعد از استفاده از آنزیم آسپاراژیناز می‌تواند مرگ را برای این سلول‌ها به دنبال داشته باشد. هدف از این طرح، بررسی امکان تولید و تخلیص آنزیم آسپاراژیناز می‌باشد.روش‌ها: ژن آنزیم آسپاراژیناز موجود در ژنوم باکتری اشرشیاکلی با استفاده از تکنیک pcr تکثیر شد. پس از تخلیص، ژن فوق در وکتور pet28a کلون و به میزبان باکتری انتقال داده شد. پس از ترانسفورماسیون، شرایط مختلف بیان پروتئین جهت بهینه‌سازی بررسی گردید. بیان آنزیم نوترکیب به کمک sds-page و وسترن بلات تایید شد. سپس آنزیم آسپاراژیناز با روش کروماتوگرافی تمایلی و با کمک ستون حاوی رزین ni-nta و روش هیبرید خالص شد و در نهایت فعالیت آنزیمی آن بررسی گردید.یافته‌ها: بیشترین میزان تولید آنزیم آسپاراژیناز در باکتری در دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد، غلظت 1 میلی‌مولار از القاگر و زمان 20 ساعت پس از القاء بود. آنزیم آسپاراژیناز نامحلول با استفاده از ستون نیکل خالص شده و روی ستون فرایند تاخوردگی مجدد (refolding) انجام شد. با توجه به فعالیت آنزیم ریفولد شده در تست فعالیت آنزیمی می‌توان نتیجه گرفت فرایند تاخوردگی مجدد آنزیم به درستی انجام شده است. نتیجه‌گیری: به دلیل اهمیت زیاد تولید آنزیم آسپاراژیناز در ایران و نیاز گروهی از بیماران برای استفاده از این آنزیم، در این پروژه با بهینه کردن فرایند بیان و تخلیص، آنزیم l-asparaginase در مقیاس آزمایشگاهی تولید شد.

production of recombinant e.coli asparaginase on a laboratory scale

background: l-asparaginase is an enzyme derived from e. coli and is one of the drugs used to treat acute lymphoblastic leukemia. decreased blood asparagine after the use of the asparaginase can lead to death for these cells. the aim of this project is to investigate the possibility of the production and purification of theasparaginase enzyme.methods: the asparaginase gene of e. coli was amplified using pcr technique. after purification, the gene was cloned into pet28a vector and transformed into a bacterial host. after transformation, different protein expression conditions were investigated for optimization. recombinant enzyme expression was confirmed by sds-page and western blotting. the asparaginase enzyme was then purified by affinity chromatography using a column containing ni-nta resin and a hybrid method and finally, its enzymatic activity was investigated.findings: the high production of asparaginase enzyme in e. coli was at 37 °c, 1 mm concentration of iptg, and incubation 20 hours after induction. insoluble asparaginase enzyme was purified using a ni-nta column and the refolding process was performed on the column. according to the activity of the refolded enzyme in the enzyme activity test, it can be concluded that the refolding process of the enzyme has been done correctly.conclusion: due to the great importance of asparaginase production in iran and the need of a group of patients to use this enzyme, in this project, by optimizing the expression and purification process, the l-asparaginase enzyme was produced on a laboratory scale.