ساخت و تعیین خصوصیت سلول نوترکیب T 293hek با بیان بالای 3tim

مقدمه: گلیکوپروتئین 3tim (3t-cell immunoglobulin and mucin domain) یکی از نشانگرهای سطح سلولی سلول‌های 1th (1t helper) است که در بسیاری از بیماری‌های مرتبط با سیستم ایمنی، تغییر بیان دارد. این مطالعه، با هدف بررسی و افزایش بیان پروتئین 3tim در سطح سلول t293 انجام شد.روش‌ها: کاست بیانی 3tim از روی پلاسمید 67m-2682w-ex با استفاده از پرایمرهای دارای جایگاه آنزیمی nhei و mlui تکثیر و در جایگاه‌های مربوط در پلاسمید phygro ساب کلون شد. پلاسمید نوترکیب محتوی ژن 3tim (3ph-tim) پس از استخراج و خالص‌سازی، با آنزیم nhei خطی شد و در سلول‌های t293 با استفاده از روش کلسیم فسفات ترانسفکت شد. سپس سلول‌های نوترکیب t293 بیان کننده‌ی 3tim در محیط حاوی هیگرومایسین انتخاب مثبت شدند. پس از یک ماه بر روی dna ژنومیک کلون‌های سلولی باقی‌مانده، واکنش pcr (polymerase chain reaction) به منظور بررسی ادغام 3cdnatim (complementary dna) در ژنوم سلول t293 انجام شد. همچنین میزان بیان پروتئین 3tim در سطح سلول به روش فلوسایتومتری ارزیابی گردید.یافته‌ها: نتایج هضم آنزیمی با آنزیم‌های nhei و mlui بر روی پلاسمید 3p-h-tim باند 2312 و 4600 جفت بازی را نشان داد که تایید کننده‌ی صحت کلونینگ است. در واکنش pcr بر روی dna ژنومیک، باند 1100 جفت بازی تکثیر شد که نشانه‌ی ورود ژن 3tim در ژنوم سلول t293 می‌باشد. همچنین در فلوسایتومتری، 88 درصد سلول‌ها از نظر بیان 3tim مثبت بودند و شدت بیان در قسمت زیادی از سلول‌ها بالا بود.نتیجه‌گیری: بیان پروتئین در سیستم‌های بیانی پروکاریوت‌ها از نظر زمان و هزینه بهتر از سیستم‌های یوکاریوتی است، اما در مورد پروتئین‌های دارای تغییرات پس از ترجمه، این سیستم بیانی جوابگو نیست. در برخی موارد ساختار فضایی طبیعی پروتئین در موقع لنگر انداختن بر سطح غشا، در تولید پروتئین‌های غشایی مانند 3tim در سیستم‌های یوکاریوتی، حفظ نمی‌شود. در نتیجه، برای استفاده در تحقیقات تهیه‌ی آنتی‌بادی‌هایی که اپی‌توپ‌های فضایی را می‌شناسند و یا انتخاب آپتامر، مناسب نمی‌باشند. بیان پروتئین 3tim در سطح سلول، می‌تواند ارایه دهنده‌ی پروتئین با ساختار فضایی طبیعی در پروژه‌های تولید آنتی‌بادی، نانوبادی و آپتامر باشد.