کلونینگ، بیان و ارزیابی فعالیت اگزوتوکسین a نوترکیب سودوموناس آئروژینوزا

مقدمه: امروزه در بسیاری از مطالعات مربوط به درمان سرطا‌ن‌های مختلف، از هدفمند نمودن ترکیبات سمی علیه سلول‌های سرطانی استفاده می‌شود. یکی از این ترکیبات بسیار موثر، اگزوتوکسین a سودوموناس می‌باشد. هدف از این مطالعه، بررسی بیان و تخلیص و ارزیابی فرم کوتاه شده‌ای از این توکسین در سیستم بیانی پروکاریوتی بود.روش‌ها: در ابتدا توالی فرم کوتاه شده‌ی توکسین (38pe) با استفاده از پرایمرهای دارای جایگاه برش آنزیمی hindiii و ndei از روی وکتور 57-puc حاوی این ژن تکثیر شد. بعد از برش آنزیمی، داخل وکتور b26-pet خطی شده با این آنزیم‌های برشی کلون گردید. ارزیابی و تایید ساختار وکتور نوترکیب به وسیله‌ی هضم آنزیمی و تعیین توالی، مورد بررسی قرار گرفت. وکتور نوترکیب به داخل باکتری‌های (3de)21bl، plyss(3de)21bl و rosetta ترانسفورم شد و بعد از بیان و تخلیص توکسین، ارزیابی عملکرد آن در سلول‌های یوکاریوتی huvec و kdr293 انجام شد.یافته‌ها: توالی ژن توکسین با موفقیت تکثیر گردید و با هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت کلونینگ اثبات گردید. وکتور نوترکیب در e.coli (escherichia coli) بیان و به وسیله‌ی توالی هیستیدینی با موفقیت تخلیص گردید. در نهایت، توکسیسیتی توکسین تخلیص شده توسط آزمایش mtt (bromide diphenyltetrazolium-5،2-(yl-2-dimethylthiazol-5،4)-3) بر روی دو رده‌ی سلول یوکاریوتی kdr293 و huvec مورد بررسی قرار گرفت.نتیجه‌گیری: با توجه به ساخت موفقیت‌آمیز وکتور نوترکیب 38pe-b26-pet و ترانسفورم آن به داخل سلول‌های پروکاریوتی، میزان بیان در سلول‌های مختلف e.coli متفاوت بود؛ به گونه‌ای که میزان بیان آن در (3de)21bl بیشتر بود. از آن جایی که قسمت اتصالی توکسین در فرم کوتاه شده وجود ندارد، بنابراین در ارزیابی سلولی بر اساس مطالعه‌ی قبلی، دوز کشندگی آن بیش از هزار برابر بیشتر از نوع هدفمند شده‌ی آن با عامل رشد عروقی 121vegf می‌باشد.