جداسازی پلاسماسل از خون محیطی و هم‌کشتی با سلول استرومای مغز استخوان به منظور کشت طولانی مدت

مقدمه: فن‌آوری تهیه‌ی آنتی ‌بادی بر پایه‌ی تک سلول b روشی‌ نوین در تهیه‌ی آنتی ‌بادی مونوکلونال انسانی محسوب می‌گردد. مهم‌ترین بخش‌ این فن‌آوری، کشت طولانی مدت پلاسماسل جدا شده از خون جهت ترشح آنتی ‌بادی است. با توجه به این که دلیل زنده ماندن طولانی مدت پلاسماسل‌ها در مغز استخوان حضور سیگنال‌های اطراف آن‌ها است، جهت کشت پلاسماسل در شرایط in vitro لازم است این سیگنال‌ها به واسطه‌ی حضور یک لایه سلول تغذیه‌ کننده تامین شوند. به نظر می‌رسد که از میان انواع مختلف این سلول‌ها، سلول‌های استرومای مغز استخوان (bmscs یا bone marrow stromal cells) گزینه‌ی مناسب‌تری جهت هم‌کشتی با پلاسماسل محسوب می‌گردند. هدف از این پژوهش، جداسازی پلاسماسل‌های ترشح کننده‌ی آنتی ‌بادی از خون محیطی‌ و زنده نگهداشتن آن‌ها در شرایط in vitro می‌باشد.روش‌ها: پس از تزریق واکسن کزاز، تیتر آنتی ‌بادی در سرم خون افراد داوطلب با روش elisa (enzyme-linked immunosorbent assay) اندازه‌گیری شد. pbmcs (peripheral blood mononuclear cells) جدا شده از خون فرد ایمن با آنتی ‌بادی‌های رنگی اختصاصی سه نشانگر سطحی 45cd، 19cd و 38cd رنگ‌آمیزی شدند. پس از آن پلاسماسل‌ها به روش facs (fluorescence-activated cell sorting) از سایر جمعیت‌های سلولی موجود، جدا و در پلیت 96 خانه‌ای sort شدند. سپس همراه با یک لایه bmscs کشت داده شدند. پس از گذشت 10 روز، از پلاسماسل‌‌ها rna استخراج شد و واکنش rt-pcr (reverse transcription polymerase chain reaction) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی ‌بادی انجام شد.یافته‌ها: روز ششم پس از واکسیناسیون، تیتر آنتی ‌بادی سرم، iu/ml 16 به دست آمد که نشان از پاسخ ایمنی بسیار مناسب در مقابل واکسن کزاز بود. همچنین، آنالیز فلوسایتومتری نمونه‌ی خون محیطی فرد ایمن شده در روز هفتم، درصد پلاسماسل موجود در pbmcs را حدود 0/3 درصد نشان داد. در نتیجه‌ی انجام واکنش rt-pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی ‌بادی، قطعه‌ی vh (variable heavy chain) به طول bp 400 تکثیر شد. این نتیجه، زنده بودن پلاسماسل‌ها و همچنین بیان ژن آنتی ‌بادی را در روز دهم در شرایط هم‌کشتی با bmscs تایید نمود.نتیجه‌گیری: حاصل این پژوهش، فراهم آوردن شرایط مناسب به منظور کشت پلاسماسل برای مدت 10 روز در محیط in vitro بود. بنابراین بخشی از فن‌آوری نوین تهیه‌ی آنتی ‌بادی بر پایه‌ی تک سلول b نیز پایه‌گذاری شد. نتایج به دست آمده در این پژوهش شامل درصد پلاسماسل موجود در pbmcs و اندازه‌ی قطعه‌ی ژنی vh تکثیر شده، با سایر مطالعات انجام شده در این زمینه مطابقت داشت.