ساخت و تعیین خصوصیت سلول نوترکیب hek با بیان بالای toso/faim3 و ارزیابی بیان آن

مقدمه: پروتئین‌های غشایی در فرایندهای سلولی با ارزش شامل انتقال سیگنال، عبور و مرور مواد و ارتباطات سلولی نقش دارند و به منظور درمان بیماری‌ها و اختلالات، مورد هدف داروها قرار می‌گیرند. سیستم‌های بیانی متفاوتی برای تولید میزان زیادی از این پروتئین‌ها به کار رفته‌اند که سلول‌های پستانداران با تولید ساختارهای نزدیک به فرم طبیعی این پروتئین‌ها مناسب‌ترین آن‌ها هستند. toso/faim3 (fas apoptosis inhibitory molecule)، یک پروتئین غشایی به شدت حفاظت شده است که نقش مهمی را در بقا، نظارت بر سیستم ایمنی و هموستاز بر عهده دارد. هدف از این مطالعه، بیان toso به میزان زیاد در سطح سلول hek-293t (human embryonic kidney-293t) می‌باشد. روش‌ها: وکتور بیانی یوکاریوتیک pez-m67-toso به منظور تکثیر پلاسمید در باکتری escherichia coli سویه‌ی top10f’ ترانسفورم شد. سپس، پلاسمید استخراج شد و با آنزیم محدودالاثر eco31i مورد هضم آنزیمی قرار گرفت تا پلاسمید خطی شود. پس از آن، سلول‌های hek-293t با پلاسمید خطی ترانسفکت شدند و به منظور غربالگری سلول‌های پایدار بیان کننده‌ی toso، تحت تیمار با هیگرومایسین قرار گرفتند. کلون‌های مقاوم پس از سه هفته تکثیر شدند. سپس، dna کروموزومی از سلول‌های ترانسفکت شده استخراج شد و حضور cdna toso در ژنوم hek-293t به وسیله‌ی روش pcr (polymerase chain reaction) مورد سنجش قرار گرفت. علاوه بر این، برای بررسی میزان بیان toso از روش real-time pcr استفاده گردید. یافته‌ها: ورود cdna toso در داخل ژنوم سلول‌های انتخاب شده، تایید گردید. سلول‌های hek-293t، mrna toso را به میزان متوسط 1700 مولکول در هر سلول بیان کردند. نتیجه‌گیری: سلول‌های hek-293t به دلیل سهولت در ترانسفکشن و رشد سریع، مناسب‌ترین گزینه برای بیان پروتئین می‌باشند. بیان غشایی پروتئین toso حتی نسبت به پروتئین نوترکیب خالص شده از سیستم بیانی رده‌ی سلولی پستانداران نیز تاخوردگی طبیعی‌تری دارد. از رده‌ی سلولی hek-293t ساخته شده در این تحقیق که با بیان بالای toso همراه بود، در مطالعات بعدی جهت تعیین خصوصیت و ساختار بیوفیزیکی و بیوشیمیایی آن و تحقیقات دارویی و زیستی می‌توان استفاده نمود.