بیان پروانسولین انسانی در گیاه با استفاده از ناقل pvut (plasmid viral university of tehran)

مقدمه: انسولین هورمون پروتئینی است که توسط سلول‌های بتای پانکراس ترشح می‌شود. به علت معایب تولید پروتئین‌های نوترکیب در میکروارگانیسم‌ها، هزینه به نسبت بالا، امکان آلودگی با پروتئین‌های سمی و مراحل هزینه‌بر خالص‌سازی، تولید پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان امری قابل بررسی است. توسعه‌ی سیستم بیان گذرا بر پایه‌ی نوع حذف شده‌ی rna-2 ویروس موزائیک لوبیا چشم بلبلی (cowpea mosaic virus-hyper translatable یا cpmv-ht)، امکان تولید سریع و سطوح بالای پروتئین‌ها را بدون استفاده از همانندسازی ویروسی فراهم کرده است.روش‌ها: در این مطالعه، سازه‌های pbi121-proinsulin-zera (pbi-proz) در بر دارنده‌ی توالی ژن پروانسولین انسانی و zera (دومین انتهای n غنی از پرولین گاما- زئین ذرت) و pcambia1304-proinsulin-extensin (pcambia-proe) در بر دارنده‌ی سیستم بیانی cpmv-ht، به منظور بهبود ترجمه‌ی ژن پروانسولین انسانی و توالی سیگنال پپتید اکستنسین هویج ساخته شد. این دو سازه، به واسطه‌ی باکتری agrobacterium tumefaciens pv. c58، به صورت بیان گذرا به گیاهان کاهو و یونجه انتقال داده شدند. تحلیل آماری این پژوهش بر پایه‌ی آزمایش فاکتوریل، در قالب طرح به‌کلی تصادفی بر روی غلظت پروانسولین تولیدی در هر گرم برگ تراریخت صورت گرفت. بیان ژن پروانسولین در بافت گیاهی تراریخت در سطح رونویسی، با استفاده از واکنش reverse transcription polymerase chain reaction (rt-pcr) و در سطح ترجمه، با استفاده از آزمون لکه‌گذاری نقطه‌ای و enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) مورد تایید قرار گرفت.یافته‌ها: میزان پروانسولین فعال تولیدی با سازه‌های pcambia-proe و pbi-proz، در برگ‌های یونجه تراریخت، به ترتیب 6/82 و 4/32 نانوگرم در هر گرم برگ تر و در برگ‌های کاهوی تراریخت، به ترتیب 6/6 و 3/8 نانوگرم در هر گرم برگ تر بود.نتیجه‌گیری: طبق نتایج به دست آمده از این تحقیق، میزان بیان پروتئین پروانسولین در سازه‌ی pcambia-proe در بر دارنده‌ی خصوصیات سیستم بیانی cpmv-ht، بیشتر از سازه‌ی pbi-proz بود.

Plant Expression of Human Proinsulin Using the Plasmid Viral University of Tehran (pVUT) Vector

<p dir=LTR><strong>Background<em>: </em></strong>Insulin is a hormone exclusively produced by <em>pancreatic</em> beta <em>cells</em>. The production of recombinant proteins in microorganisms has some disadvantages such as high cost, the possibility of contamination with toxic proteins, and costly purification steps; so, the production of recombinant proteins in plants can be investigated. Development of transient expression system based on a deleted version of Cowpea mosaic virus RNA2, Cowpea Mosaic <em>VirusHyper Translatable (</em>CPMVHT), has provided the extremely highlevel and rapid production of proteins without viral replication.</p><p dir=LTR><strong>Methods:</strong> In this study, two constructions were prepared; pBI121ProinsulinZera (pBIProZ) containing human proinsulin gene and Zera (Nterminal prolinerich domain of γzein) and pCAMBIA1304ProinsulinExtensin (pCAMBIAProE) containing CPMVHT expression system for improvement of translation of human proinsulin gene and carrot extensin signal peptide. Both structures were transiently transferred in to lettuce and alfalfa leaves using <em>Agrobacterium tumefasiens</em> pv. C58. Statistical analysis of this study was conducted on the concentration of produced proinsulin per each gram of transgenic leaf using factorial arrangement of treatment in a complete randomized design. Gene expression was confirmed in transcription level using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) method and in translation level using enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) and Dot blot assay.</p><p dir=LTR><strong>Findings:</strong> Protein accumulation for pCAMBIAProE and pBIProZ constructs were 6.82 and 4.32 ng/g in recombinant alfalfa leaves and 6.6 and 3.8 ng/g in recombinant lettuce leaves, respectively.</p><p dir=LTR><strong>Conclusion:</strong> Results showed that the expression of proinsulin in pCAMBIAProE contains CPMVHT expression system was more than pBIProZ.<strong></strong></p>