بیان دو سیسترونی و پایدار فاکتور 9 انعقادی انسانی و پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در سلول‌های تخمدان همستر چینی سازگار با کشت معلق

زمینه و هدف: درمان فعلی هموفیلی b درمان جایگزینی است که شامل تزریق داخل وریدی فاکتور 9 انسانی خالص شده از پلاسما یا فرم نوترکیب تولید شده در سلول‌های پستانداران است. در تحقیق حاضر با استفاده از یک سیستم بیانی دو سیسترونی، بیان پایدار فاکتور 9 انسانی در ردۀ سلولی تخمدان همستر چینی سازگار با کشت معلق (cho-s) و محیط عاری از سرم مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها: یک قطعه dna متشکل از توالی های نوکلئوتیدی فاکتور 9 انسانی، جایگاه میانی ورود ریبوزوم و پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در وکتور بیانی pcdna3.1 تحت کنترل پروموتر سایتومگالو ویروس همسانه سازی شد. پلاسمید دوسیسترونی حاصل با استفاده از آنزیم برشگر bglii خطی و در سلول‌های cho-s ترانسفکت شد. سلول‌های ترنسفکت شده به مدت 14 روز تحت تیمار با ماده جنتیسین قرار گرفتند. سپس محیط کشت سلول‌های پایدار جمع‌آوری و بیان فاکتور 9 با استفاده از وسترن بلاتینگ و الایزا بررسی شد. فعالیت انعقادی نیز با روش کروموژنیک مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته ها: سلول های cho-s نوترکیب و مقاوم به جنتیسین، زیر میکروسکوپ فلورسنت به رنگ سبز مشاهده شدند که حاکی از بیان و تجمع پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده در سیتوپلاسم سلول‌ها بود. نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ، بیان و ترشح فاکتور 9 نوترکیب به داخل محیط کشت را تائید کرد. مقدار فاکتور 9 ترشح شده ng/ml/10^6 150 و فعالیت انعقادی آن mu/ml 0/2 ± 5/6 محاسبه شد. نتیجه‌گیری: یافته های ما نشان داد که این سیستم بیانی دو سیسترونی توانایی تولید هم‌زمان پروتئین فلورسنت سبز تقویت شده و فاکتور 9 انسانی را در سلول‌های cho-s دارد. این سامانه بیانی، فرایند انتخاب و جداسازی سلول‌های بیان کننده فاکتور 9 را تسهیل می‌کند.

bicistronic and stable expression of human coagulation factor ix and enhanced green fluorescent protein in suspension-adapted chinese hamster ovary cells

background and aim: the current treatment for hemophilia b is replacement therapy, which involves the intravenous infusion of human coagulation factor ix (hfix) purified from plasma or a recombinant form produced in mammalian cells. in this study, using a bicistronic expression system, the stable expression of the hfix in a serum-free and suspension-adapted chinese hamster ovary cell line (cho-s) was investigated. materials and methods: a dna fragment consisting of hfix, internal ribosome entry site (ires) and enhanced green fluorescent protein (egfp) nucleotide sequences was cloned into pcdna3.1 expression plasmid under the control of cytomegalovirus (cmv) promoter. the bicistronic plasmid was then linearized using bglii restriction enzyme and transfected into cho-s cells. the transfected cells were treated with geneticin for 14 days. the culture medium of the stable cells was then collected and the expression level of the hfix were examined using western blotting and elisa. the coagulation activity was also evaluated by the chromogenic method. results: the recombinant cho-s cells resistant to geneticin were observed under a fluorescence microscope in green color, which indicated the expression and accumulation of the egfp in the cytoplasm of the cells. the results of western blotting confirmed the expression and secretion of the hfix into the culture medium. the amount of the secreted hfix was 150 ng/ml/10^6cells with a coagulation activity of 5.6 ±0.2 mu/ml. conclusion: our findings demonstrated that this bicistronic expression system could simultaneously produce egfp and hfix in cho-s cells. this expression system facilitates selection and isolation of hfix-expressing cells.