طراحی گام ‌به‌گام وکتورهای محبوب و شایع در دست‌ورزی ژنتیکی با استفاده از سیستم crispr/cas9

زمینه و هدف: ویرایش ژنوم روشی کارآمد و دقیق در مطالعات بیولوژیکی و پزشکی است. در میان طیف وسیعی از تکنیک‌های ویرایش ژنوم، تکرارهای کوتاه پالیندرومی بافاصله منظم خوشه‌ای (crispr) یکی از ساده‌ترین روش‌ها و درعین‌حال بسیار امیدوارکننده است. سیستم crispr از دو جزء کلیدی تشکیل شده است. یک آنزیم اندونوکلئاز به نام cas9 و یک هدایت‌کننده rna (grna) که اطمینان حاصل می­کند که آنزیم cas9 نقطه مناسبی از ژنوم را برش می­دهد. اگرچه ویرایش ژنوم بر پایه crispr یکی از روش‌های مفید برای اصلاح ژنوم است؛ اما هنوز چالش‌های متعددی در مراحل این تکنیک وجود دارد. مواد و روش‌ها: rna های راهنما بر اساس مکان هدف و وکتور موردنظر طراحی و سفارش داده شدند. مراحل کلونینگ انجام شد و با تعیین توالی، به‌عنوان یک روش استاندارد طلایی تایید شدند. فهرستی از rna های راهنما کارآمد برای ژن lamp-2 بر اساس پایگاه‌های داده برجسته موجود و با تجزیه‌وتحلیل و مقایسه اختصاصیت و عملکرد به‌عنوان دو ویژگی اصلی فراهم شد. یافته‌ها: در این مطالعه سعی شده است تا چالش‌های اصلی در فرایند تهیه وکتورهای محبوب (px330/px459) سیستم crispr/cas9 بررسی شوند. همچنین فهرستی از rna های راهنما کارآمد برای یک ژن اتوفاژی نیز به‌عنوان‌ مثال برای روشن شدن روش‌های طراحی rna راهنما فراهم آمده است. نتیجه‌گیری: در این مقاله سعی شده است تا مشکلاتی که احتمال می‌رود در طول طراحی rna راهنما و آماده‌سازی پلاسمید به وجود آید، به تصویر کشیده شوند و به دنبال آن توصیه‌های مناسب برای حل آن‌ها ارائه شود.

step by step design of popular and common vectors in genetic manipulation using crispr/cas9 system

background and aim: genome editing is an efficient and accurate method in biological and medical studies. among the wide range of genome editing techniques, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (crispr) is one of the simplest and yet promising methods. the crispr system consists of two key components; an endonuclease enzyme called cas9 and guide rna (grna), ensuring that cas9 enzyme cuts at the right point in the genome. although crispr genome editing is one of the useful methods to modify the genome, there are still multiple challenges in the technique steps.materials and methods: sgrnas were designed and ordered accordingly on the basis of the target site and vector of interest. cloning procedures were performed and confirmed by sequencing as a gold standard. the list of high efficient sgrnas for the lamp-2 gene was prepared based on the available outstanding databases by analyzing and comparing the specificity and functionality as two main characteristics.results: in this study, we tried to evaluate the main challenges in the process of preparing crispr/cas9 popular vectors (px330/px459). a list of high efficient sgrnas for an autophagy gene is also prepared as an example for clarification of the sgrna design procedures.conclusion: this study tried to depict problems that may be encountered during sgrna design and plasmid preparation, followed by giving appropriate recommendations.