تولید سازه نوترکیب با همسانه سازی ژن دومین 4 آنتی ژن حفاظتی و هم جوشی آن با ژن دومین 1 فاکتور کشنده باسیلوس آنتراسیس در اشرشیاکلی

مقدمه: سیاه زخم یک بیماری مشترک بین انسان و دام است. عامل ایجاد کننده این بیماری مهلک باکتری باسیلوس آنتراسیس می باشد. در حال حاضر آنتی ژن حفاظتی(pa) به عنوان واکسن موثر سیاه زخم مورد استفاده قرار می گیرد. دومین 4 این آنتی ژن به همراه دومین 1 فاکتور کشنده(lf)، ایمونوژن های قوی این باکتری بوده و به عنوان کاندید مناسب واکسن علیه آن مطرح می باشند. هدف ما در این تحقیق، همسانه سازی ژن دومین 4 آنتی ژن حفاظتی(pad4) و هم جوشی آن با ژن دومین 1 فاکتور کشنده(lfd1) باکتری، به منظور بررسی توانایی آن ها در القاء ایمنی حفاظتی می باشد.مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی، از یک وکتور pgemt easy نوترکیب حاوی ژن lfd1 استفاده شد. سپس ژن pad4 با واکنش آنزیمی pcr تکثیر و جداسازی شده و به طور جداگانه در وکتور pgemt easy دیگری همسانه سازی گردید. بعد از آن واکنش الحاق ژن pad4 به ژن lfd1 در وکتور فوق با تعیین جهت گیری lfd1 و توسط جایگاه های آنزیمی psti و xbai انجام پذیرفت. سازه نوترکیب حاصل از دو ژن فوق در ناقل بیانی pet28a به کمک آنزیم های محدود الاثر bamhi و xhoi زیر همسانه سازی گردید و پس از تعیین جهت گیری ژن ها، میزبان بیانی bl21 توسط این ناقل نوترکیب تراریخت گردید.یافته های پژوهش: همسانه سازی اولیه و هم جوشی قطعات ژنی pad4 و lfd1 در ناقل pgemt easy با موفقیت انجام شد و پس از تایید فرآیند فوق با دو روش برش آنزیمی و pcr، سازه نوترکیب حاصل با موفقیت در pet28a زیر همسانه سازی شد.بحث و نتیجه گیری: با توجه به ایمونوژن بودن نواحی pad4 و lfd1، بیان پروتیئن این سازه نوترکیب حاصل از نواحی ژنی الحاق شده فوق، می تواند برای القاء ایمنی محافظتی، به عنوان کاندید مناسب واکسن سیاه زخم مطرح باشد.

Production of Recombinant Construct by Cloning of Protective Antigen Domain 4 Gene and Fusion of it with Lethal Factor Domain 1 Gene of Bacillus anthracis in E.coli

Introduction: Anthrax is a zoonotic disease. Bacterium Bacillus anthracis is the causative agent of the fatal disease. At present, the protective antigen (PA) is used as an effective vaccine against anthrax. Domain 4 of this antigen together with domain 1 of lethal factor (LF) are the potent immunogens of this bacteria and are as suitable candidates of vaccine against it. Our aim in this study is the cloning of protective antigen domain 4 (PAD4) genes and fusion of it with lethal factor domain 1 (LFD1) gene of the bacteria to evaluate their capability in protective immunity induction.Materials methods: In this experimental study, we used a recombinant pGEMT easy vector containing LFD1 gene. Then PAD4 gene was amplified and isolated by PCR and cloned into another pGEMT easy vector, separately. After that, ligation of PAD4 gene and LFD1 gene was done in mentioned vector with determination of LFD1 orientation and by PstI/XbaI restriction sites. The recombinant construct, resulted from these genes was subcloned into pET28a expression vector using BamHI/ XhoI restriction enzymes and after determination of genes orientation, the expression host BL21 was transformed by this recombinant vector.Findings: First cloning and fusion of PAD4 and LFD1 gene fragments were successfully carried out in pGEMT easy vector and after the confirmation of mentioned process by both of enzymatic digestion and PCR methods, the result recombinant construct was subcloned into pET28a.Discussion Conclusions: Since PAD4 and LFD1 are immunogenic regions, expression of the recombinant construct resulted from these ligated genes can be proposed as proper candidate of anthrax vaccine for induction of protective immunity.