کلونینگ ناحیه ایمونوژنیک توکسین b کلستریدیوم دیفیسیل در لاکتوکوکوس لاکتیس با هدف توسعه واکسن دهانی مبتنی بر لاکتوکوکوس علیه کولیت ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل

مقدمه: باکتری کلستریدیوم دیفیسیل عامل ایجاد عفونت بیمارستانی و کولیت غشای کاذب می باشد. توکسین b این باکتری به عنوان یکی از فاکتورهای اصلی بیماری زایی این باکتری شناخته شده است. ناحیه اتصالی پذیرنده(rbd) این توکسین، ناحیه ایمنی زای توکسین شناخته و به گیرنده واقع در روده متصل می شود. هدف این مطالعه کلون نمودن و بیان ناحیه ایمنی زای توکسین b در باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس به منظور تهیه واکسن دهانی مطمئن و ایمن علیه کولیت ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل، به عنوان یک روش درمانی جایگزین در مطالعات آینده و مبتنی بر لاکتوکوکوس می باشد.مواد و روش ها: ابتدا با استخراج dna از باکتری کلستریدیوم دیفیسیل و با پرایمرهای طراحی شده، قطعه rbd به روش pcr تکثیر شد. قطعه تکثیر شده در پلاسمید ptz57r/t الحاق و در باکتری e.coli ترانسفورم شد. سپس قطعه rbd با برش آنزیمی توسط آنزیم های ncoi و saci، از پلاسمید ptz57r/t خارج و خالص سازی شد. قطعه rbd در پلاسمید بیانی pnz8149برش خورده با آنزیم‌ های مشابه تحت شرایط مناسب الحاق شد. سپس پلاسمید بیانی pnz8149 حاوی قطعه با روش الکتروپوریشن درون سلول های مستعد لاکتوکوکوس لاکتیس ترانسفورم شد.یافته های پژوهش: پس از غربالگری کلونی های ترانسفورم شده، صحت کلونینگ با انجام pcr، هضم آنزیمی بر روی پلاسمید نوترکیب استخراج شده و نهایتاً با تعیین توالی، تایید شد. بحث و نتیجه گیری: لاکتوکوکوس لاکتیس تولید کننده این ناحیه ایمنی زا می تواند به منظور تهیه واکسن دهانی مطمئن و ایمن، به عنوان یک روش درمانی جایگزین جهت کاهش شیوع عفونت کلستریدیوم دیفیسیل در مطالعات آینده مورد استفاده قرار گیرد.

Cloning of Immunogenic Domain of Clostridium Difficile Toxin B in Lactococcus lactis to Develop an Oral Vaccine Based on Lactococcus against Clostridium difficile Associated Colitis

Introduction: Clostridium difficile bacterium is the leading cause of clinical infection and pseudomembranous colitis. Toxin B (TcdB) of C. difficile is regarded as one of the main virulence factors of this bacterium. Moreover, the receptor binding domain (RBD) of this toxin which is known as an immunogenic domain attaches to its receptor in intestine. This study aimed to clone and express the immunogenic domain of the Toxin B in Lactococcus lactis to provide a safe oral vaccine against colitis caused by C. difficile as an alternative treatment in future studies based on Lactococcus. Materials Methods: In order to clone this segment, at first, the DNA was extracted from C. difficile, and then, the RBD gene segment was amplified by the PCR method using designed primers. The amplified segment was attached to pTZ25R/T plasmid and transformed into Escherichia coli. Subsequently, the RBD segment was extracted from pNZ9418 plasmid using restriction enzymes, such as SacI and NcoI, and then it was purified in this study. Following that, the RBD segment was cut in pNZ8149 plasmid using the same enzymes and was attached under the proper condition. The pNZ8149 plasmid with segment was transformed into L. lactic competent cells by electroporation method. Findings: After the screening of electrotransformed colonies, the accuracy of cloning was verified using PCR, enzyme digestion on the extracted recombinant plasmid, and sequencing. Discussion Conclusions: According to the results, L. lactic which produces the immunogenic domain can be used as a safe oral vaccine and can be considered as an alternative therapy to reduce the incidence of Clostridium difficile infection in further investigations.