بررسی تاثیر مهارکننده پروتئازوم (mg132) در تنظیم مرگ سلولی، آپوپتوز، فعالیت کاسپازها، میزان گونه‌های فعال اکسیژن و پتانسیل غشای میتوکندری در رده سلولی سرطان سینه (mcf-7)

زمینه و هدف: mg132  به عنوان مهارکننده مسیر پروتئوزوم در تنظیم احتمالی مرگ سلول‌های سرطانی مورد توجه قرار گرفته است. این مطالعه با هدف روشن کردن اثر احتمالی mg132 بر تنظیم رشد و القای  آپوپتوز با تاکید بر نقش کاسپاز‌ها، گونه‌های فعال اکسیژن و میتوکندری در سلول‌های سرطانیmcf-7  طراحی شده است.روش کار: مطالعه حاضر از نوع مطالعات علوم پایه و در سطح سلول می‌باشد. برای این منظور، سلول‌های mcf-7 در گروه‌های تیمار با  غلظت‌های مختلف mg132 (0.5، 1، 5 و 10 میکرومول)  در زمان‌های انکوباسیون 12، 24 و 48 ساعت قرار گرفتند. اثر سمیت سلولی mg132 بر رشد mcf-7  با استفاده از روش mtt بررسی گردید. رنگ آمیزی annexin-v-fitc و رنگ آمیزی pi برای تشخیص آپوپتوز اولیه و تاخیری  با استفاده از فلوسیتومتری استفاده گردید.  سطح پتانسیل غشای میتوکندری δψm)) با استفاده از رنگ لیپوفیل  jc-1 تغییر رنگ و جذب نوری حاصل از آن،  تشکیل گونه‌های فعال  اکسیژن  (ros) با استفاده از پروب فلورسنس 2',7' -dichlorofluorescin diacetate (dcfh-da) و فعالیت کاسپاز‌های 3 و 8  به روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. برای تجزیه و تحلیل و مقایسه داده‌ها از تحلیل واریانس یک طرفه ناپارامتریک (anova) با آزمون تعقیبی dennet و آزمون تعقیبی توکی با استفاده از نرم افزار graphpad prism استفاده گردید. یافته‌ها: بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه،  mg132 باعث ایجاد القای مرگ سلولی در حالت وابسته به دوز و زمان در سلول‌های سرطانی mcf-7 گردید. کاهش درصد سلول‌های زنده پس از تیمار با غلظت‌های 5 و 10 میکرومول از mg132 پس از 48 ساعت منجر به افزایش درصد سلول‌های آپوپتوزی اولیه و نیز افزایش فعالیت آنزیم‌های کاسپاز 3 و کاسپاز 8 در این سلول‌ها گردید. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد که القای آپوپتوز در سلول‌های mcf-7 بدنبال تیمار با mg132 با افزایش معنی دار تولید ros درون سلولی  (0.01>p)  و نیز کاهش قابل توجه پتانسیل غشای میتوکندری (0.001>p) همراه است. نتیجه‌گیری: نتایج مطالعه حاضر بر نقش موثر مهار سیستم پروتئوزوم ازطریق mg132 در توقف تکثیر سلول‌های mcf-7 و القای آپوپتوز و پتانسیل این ترکیب برای طراحی روش‌های درمانی موثرتر در کنترل رشد سلول‌های سرطانی سینه تاکید دارد.

evaluation of the effect of proteasome inhibitor (mg132) in regulating cell death, apoptosis, caspase activity, the amount of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in breast cancer cell line (mcf-7)

background & aims: breast cancer imposes a great burden of cancer-related mortality and morbidity in women worldwide. scientific efforts are in progress to improve the efficiency of current therapeutic strategies and reduce chemoresistance (1). due to the fact that the homeostasis of cancer cell growth is dependent on the balance between cell proliferation and cell death, the emerging role of pro-apoptotic agents to promote apoptosis and attenuate cancer cell evasion from apoptosis has opened up promising cancer therapeutic approaches (2). on the other hand, the process of protein breakdown, which involves the loss of toxic, incorrectly folded, or accumulated proteins play a critical role in normal cell fate. the protein breakdown is mainly implemented by the proteasome system that breaks the proteins into short peptides and their constituent amino acids and transfer them to the cytoplasm to reuse in the synthesis of new proteins (3). if protein breakdown is disrupted, the accumulation of incorrectly folded proteins leads to errors and induction of apoptosis (4). due to the great importance of proteosomes for cells, inhibition of their function has been proposed as a way to induce apoptosis in cancer cells (5). mg132 has been considered as a proteosome pathway inhibitor and postulated to regulate cancer cell growth and death, recently (6). it has been proposed that mg132 synergized with bevacizumab and/or cisplatin to inhibit cancer cell proliferation by triggering reactive oxygen species generation (6-8). however, the lack of sufficient evidence regarding the relevance of mg132 on breast cancer cell growth provoked us to unravel the possible effect of mg132 and its underlying mechanism in breast cancer. thus, this study is designed to elucidate the effect of mg132 on growth regulation and induction of apoptosis by emphasizing the role of caspases, reactive oxygen species, and mitochondria in mcf-7 cancer cells.methods: in this study, the human breast cancer cell lines, mcf-7 which pathologically originated from invasive carcinoma of the ducts of the breast was obtained from pasture institute of iran and cultured in rpmi 1640 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum, 100 u/ml of penicillin and 100 µg/ml of streptomycin and maintained at 37 ºc, 5% co2 and 100% humidity in the incubator. cells were treated with different concentrations of mg132 (0.5, 1, 5, and 10 μmol) at incubation times of 12, 24, and 48 hours. the cytotoxic effect of mg132 on mcf-7 growth was investigated using mtt assay and the results were expressed in terms of the percentage of viable cells relative to the control. annexin-v-fitc staining and pi staining were used to diagnose early and late apoptosis using flow cytometry. the level of mitochondrial membrane potential (δψm) was investigated using jc-1 lipophilic dye and its accumulation in mitochondria, which is associated with fluorescence emission and change of emission from green (520 nm) to red (590 nm). the formation of reactive oxygen species (ros) after treatment with different concentrations of mg132 was performed using a fluorescence probe dichlorofluorescein diacetate (dcfh-da). to evaluate the possible involvement of caspases, the activity of caspase 3 and caspase 8 was examined by the elisa method. to determine the specificity and accuracy, all experiments were repeated at least three times. the non-parametric one-way analysis of variance (anova) with dennet's post hoc test and tukey´s post hoc test were applied for analysis of differences using graph pad prism version 7 (graph pad software, san diego california)