بررسی اثرپارامترهای تاثیرگذار بر اسپرم های انسانی کپسوله شده در هیدروژل آلجینات در طی روند انجماد

زمینه و هدف: انجماد اسپرم فرایند اجتناب ناپذیری است که در مراکز درمان ناباروری انجام می‌شود و می‌تواند منجر به ایجاد آسیب‌هایی در اسپرم گردد و هنوز روش بهینه‌ای برای انجماد اسپرم معرفی نشده است. راهکارهای مختلفی در جهت حفظ سلول اسپرم برای مقابله با صدمات ناشی از انجماد وجود دارد که یکی از آن‌ها استفاده از کپسوله کردن سلول اسپرم با کمک آلجینات می‌باشد. هدف اصلی این مطالعه یافتن یک روش بهینه برای کپسوله کردن اسپرم برای استفاده در انجماد اسپرم می‌باشد.روش کار: در این مطالعه در چهار مرحله اثر غلظت‌های مختلف آلجینات، کلراید کلسیم، و نحوه افزودن مواد محافظ انجماد در روند کپسوله کردن اسپرم توسط آلجینات بررسی شد. در هر مرحله اسپرم‌ها بعد از کپسوله شدن با روش انجماد سریع منجمد شدند. بعد از ذوب و باز شدن آلجینات، حرکت و زنده‌مانی اسپرم بین گروه‌های مختلف بررسی شد. از روش رنگ آمیزی ائوزیننیگروزین برای بررسی سلامت غشاء و زنده‌مانی اسپرم استفاده شد. فراساختار هیدروژل آلجینات توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی گردید.یافته‌ها: حرکت و زنده‌مانی اسپرم در گروه آلجینات 1/5% در مقایسه با آلجینات 1%  کاهش داشت. حرکت و زنده‌مانی اسپرم در گروه 150 میکرولیتر نسبت به گروه 100 میکرولیتر کلراید کلسیم روند کاهشی نشان داد. حرکت پیشرونده و تام اسپرم بین گروه افزودن محیط محافظ انجماد قبل از کپسوله کردن و بعد از کپسوله کردن اختلاف معنی‌داری وجود نداشت. گروهی که مواد محافظ انجماد را قبل از کپسوله کردن دریافت نکرده بود نسبت به همه گروه‌ها کاهش معنی‌داری را در میزان زنده‌مانی اسپرم نشان داد. میزان حرکت تام و زنده‌مانی در گروهی که قبل از کپسوله کردن زمان داشت در مقایسه با گروهی که زمان نداشت به طور معنی‌داری بیشتر بود. ساختار متخلخل هیدروژل آلجینات توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی تایید شد.نتیجه‌گیری: آلجینات 1% به همراه 100 میکرولیتر کلراید کلسیم و استفاده از مواد محافظ انجماد قبل و بعد از کپسوله کردن روش مناسبی برای کپسوله کردن اسپرم انسان توسط آلجینات به منظور انجماد می‌باشد. این مطالعه نشان داد که آلجینات می‌تواند برای کپسوله کردن اسپرم انسان مورد استفاده قرار بگیرد و مطالعات آینده باید تاثیر آلجینات در انجماد اسپرم را مورد بررسی قرار دهند. 

evaluation of parameters affecting encapsulated human spermatozoa in alginate hydrogel during cryopreservation

background & aims: today, sperm cell cryopreservation, as a suitable method, is widely used in infertility clinics to maintain sperm cell fertility potential. but sperm cryopreservation has deleterious effects on sperm parameters. for this purpose, there are various ways to protect sperm cells during cryopreservation like sperm cell encapsulation with alginate (alg). sodium alg (c6h7o6na) is sodium salt of alginic acid, which is a natural anionic and hydrophilic polysaccharide and is mainly extracted from the cell wall of brown seaweed (7). due to its nontoxicity and high biocompatibility, alg hydrogel can create semipermeable membranes around the sperm cells (8). to the best of our knowledge, no study has been performed to optimize the method of encapsulation of sperm with alg in human sperm for clinical use. the main purpose of this study was to find an optimal method for encapsulating human sperm for use in cryopreservation. methods: in this study, in four stages, the effect of different concentrations of alg, calcium chloride, and how to add cryoprotectant agent (cpa) in the process of encapsulation of sperm by alg were investigated. in this study, the direct swimup method was used to prepare sperm samples. alg hydrogels were prepared by dissolving sodium alg powder in a water solvent (12). to evaluate the optimal concentration, the solutions were well homogenized at concentrations of 1 and 1.5% by volume (w/v) at room temperature. calcium chloride was selected as a crosslinker for crosslinking and final hydrogel formation and was used with a concentration of 102 mm/l. for evaluation of the effects of alg concentration, twelve normozoospermic samples were divided into the following groups after preparation and subjected to freezing and thawing: 1 alg 1% + cpa, 2 alg 1.5% + cpa, 3 control. to determine the best concentration of calcium chloride, which was used as a crosslinker to form alg hydrogels, twelve normozoospermic samples after preparation were divided into the following groups and then subjected to freezing and thawing: 1 alg + cpa + cacl2 (100µl), 2 alg + cpa + cacl2 (150µl): 3 control. for evaluation of addition of cpa before encapsulation, twelve normozoospermic samples, were prepared and divided into the following groups and then subjected to freezing and thawing: 1 alg + cpa, 2 alg, 3 control. to investigate the effects of giving time before encapsulation twelve normozoospermic samples were divided into the following groups and then subjected to freezing and thawing: 1 alg + (cpa + nacl), 2 alg + group (cpa + nacl) 3 min, 3 control. at each stage, the sperm samples were frozen by rapid freezing after encapsulation. to freeze the samples in the cryotube, they were first placed horizontally at a distance of three cm above the level of liquid nitrogen in the nitrogen vapor for thirty minutes and then immersed in the liquid nitrogen. during thawing, the cryotubes were placed at 35 °c for two minutes after leaving the liquid nitrogen. the samples were then transferred to a laminar hood and placed in the medium containing 150 μl of sodium citrate 119 mm/l solution at ph = 7.5. after 30 seconds, the prewarmed ham’s f10 with human serum albumin was added dropwise and after complete washing of the cryotube with the medium, the samples were centrifugated for 10 minutes at 300 g. after removing the supernatant, the final pellet was used for analysis. after thawing and dissolving alg, sperm motility and viability were assessed for all groups. eosinnigrosin staining method was used to evaluate membrane integrity and sperm viability. the ultrastructure of alg hydrogel was examined by scanning electron microscopy (sem). results: sem showed that the prepared alg hydrogel had a porous structure with interconnected porosity that could act as a semipermeable membrane.