طراحی و ساخت کانسترکت نوترکیب واجد ژن اینترفرون بتای جهش یافته در ناحیه‌ کزاک (kozak) به منظور تشدید ترجمه

زمینه و هدف: اینترفرون بتا یکی از مهمترین اعضای گروه i اینترفرون ها بوده و به عنوان داروی اصلی در بسیاری از بیماری ها از جمله بیماری مالتیپل اسکلروزیس استفاده می شود. پروتئین اینترفرون بتا واجد نیمه ی عمر کمی بوده و لذا بیماران به دریافت مکرر دارو نیازمند می باشند. با توجه به اهمیت دارویی پروتئین اینترفرون بتا، امروزه تلاش های گسترده ای در جهت بهبود سطح ترجمه و افزایش تولید آن صورت پذیرفته است. چندین عامل مهم می تواند بر روی میزان بیان پروتئین در سلول تاثیر گذار باشند که توالی مناسب احاطه کننده کدون آغاز (توالی کزاک) از جمله ی آن موارد می باشد.روش کار: پرایمرهای اختصاصی جهت ایجاد جهش هدفمند در توالی کزاک با استفاده از روش soeing pcr (splicing by overlap extension / splicing by overhang extension (soe) pcr) طراحی و pcr انجام شد. به منظور ایجاد جهش مورد نظر در ژن اینترفرون بتا سه واکنش pcr انجام پذیرفت. محصول نهایی جهش یافته و پلاسمید psvm، برش داده شده و متعاقبا اتصال بین محصولات برش داده شده توسط لیگاز انجام گرفت. پس از ترانسفورماسیون با استفاده از مخلوط لایگیشن، استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از تولید کانسترکت و تایید با استفاده از روش های هضم آنزیمی و pcr کانسترکت نوترکیب به رده ی سلولی cho با استفاده از کیت لیپوفکتامین ترانسفکت گردید.یافته ها: در تحقیق حاضر با استفاده از روش های مهندسی ژنتیک کانسترکت نوترکیب اینترفرون بتا تولید گردید. در این کانسترکت با استفاده از روش soeing pcr و ایجاد جهش های هدفمند در ناحیه ی توالی کزاک، توالی مذکور به حالت ثابت نزدیک گردید. کلنی های سفید رنگ بر روی محیط کشت پس از ترانسفورماسیون مشاهده گردید. استخراج پلاسمید از کلنی ها انجام گرفته و صحت کانسترکت نوترکیب با استفاده از هضم آنزیم و همچنین pcr تایید گردید. طول قطعه ی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی صحت کلون نمودن ژن نوترکیب اینترفرون بتا را تایید نمود. پس از تایید فرایند کلونینگ، سلول های cho کشت داده شده و ترانسفکشن پلاسمید نوترکیب به رده ی سلولی cho صورت گرفت.نتیجه گیری: جهش هدفمند در توالی کزاک ژن اینترفرون بتا صورت گرفت. جهش مورد نظر بر روی توالی کزاک می تواند سبب بهبود و افزایش میزان ترجمه پروتئین اینترفرون بتا گردد. در مراحل بعدی میزان تاثیر جهش در روند تولید پروتئین با استفاده از روش elisaبررسی خواهد شد.

Design and production of recombinant interferon beta construct with specific mutations in Kozak sequence due to promote translation

Background: Interferon beta is one of the most important members of group I interferons and is the main drug for multiple sclerosis treatment. Interferon beta has short half life and this compels patients to make frequent use of medicine. According to its clinical usage there is broad effort to improve translation level and protein production. There are several important factors which effect protein production that Kozak sequence is one of the most important one.Method: Specific primers were designed due to induce site directed mutations by SOEing PCR (Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR) method. Three PCR reactions needed to amplify recombinant interferon beta gene. The final recombinant gene and pSVM plasmid were digested by EcoRI and then ligated by DNA ligase enzyme. After transformation plasmid extraction was done and the structure of the recombinant plasmid confirmed by digestion and PCR. Finally, approved recombinant plasmid was transfected to CHO cell line by using Lipofectamine kit.Result: Genetic engineering methods were used to produce recombinant interferon beta gene. Production of recombinant construct including specific mutations in Kozak sequence was done by using SOEing PCR method. The white colonies were detected after transformation. Plasmid extraction was done and the structure of recombinant plasmid was confirmed by digestion and PCR. Expected length of fragment was observed after digestion. The CHO cells were cultured and recombinant plasmids were transfected to CHO cell line.Conclusion: These mutations will enhance and improve interferon beta protein production. The influence of these mutations in protein production will survey by using ELISA method in next phase of research.