مقایسه اثر چند بافر لیزکننده گلبول قرمز بر استخراج dna ژنومی از نمونه‌های خون منجمد در سنجش طول تلومر به روش qpcr

پیش‌زمینه و هدف: مطالعه طول تلومر برای درک فرآیند پیری و پیشگیری از بیماری‌ها بسیار مهم است. بهینه‌سازی استخراج dna از نمونه‌های خون منجمد برای حفظ طول تلومر اهمیت دارد. هدف از این مطالعه مقایسه اثر چند بافر لیزکننده گلبول قرمز بر استخراج dna ژنومی از نمونه های خون منجمد در سنجش طول تلومر به روش qpcr بود.مواد و روش‌ کار: در این مطالعه تجربی، برای استخراج dna از شش بافر مختلف لیز گلبول قرمز به همراه بافر استخراج ctab استفاده شد. مقدار dna استخراجی و خلوص آن با استفاده از اندازه‌گیری جذب و نسبت‌های 280/260a و 230/260a ارزیابی شد. یکپارچگی dna توسط الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد. تکرارپذیری عملکرد بافرها با استفاده از درصد ضریب (%cv) تغییرات برای کمیت dna ارزیابی شد. همچنین، کارایی pcr با بررسی آستانه چرخه (ct) در qpcr برای هر نمونه با استفاده از معادله رگرسیون خطی و ضریب تعیین (r2) در نرم افزار graphpad prism v10 گزارش شد. تفاوت‌ها در سطح 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد.یافته‌ها: بافر لیز با ترکیب 10 میلی مولار tris-hcl 6/7 ph و 10 میلی مولار kcl، منجر به استخراج بیشترین مقدار dna (ng/µl 01/361) شد. نتایج ژل هیچگونه خردشدگی dna در نمونه ها را نشان نداد. نسبت های جذبی در مقایسه بین بافرها تفاوت چندانی را نشان ندادند. همچنین dna استخراجی با بافر لیز با ترکیب 155 میلی مولار nh4cl، 10 میلی مولار khco3، 5 میلی مولار edta در مقایسه dna استخراجی با سایر بافرها درصد ضریب تغییرات برای کمیت dna (%7/6cv=) و میزان کارایی pcr بهتری (%103efficiency=، % 7/99r2=) در 36b4 و (%99efficiency=، % 6/99r2=) برای تلومر داشت.بحث و نتیجه‌گیری: بافر لیز با ترکیب 155 میلی مولار nh4cl، 10 میلی مولار khco3 و 5 میلی مولار edta، موثرترین عملکرد را در استخراج dna از نمونه های خون منجمد جهت مطالعه تلومر داشت. این بافر با عملکرد بهینه خود، پس از تایید نهایی توسط مطالعات بیشتر می تواند در کارآزمایی‌ها استفاده شود. 

comparative study on the effects of several erythrocyte lysing buffers on the extraction of genomic dna from frozen blood samples in evaluation of telomere length by qpcr method

background & aim: studying telomere length is very important for understanding the aging process and disease prevention. the aim of this study was to study the effects of several erythrocyte lysing buffers on the extraction of genomic dna from frozen blood samples in evaluation of telomere length by qpcr method.materials & methods: in this experimental study, six different erythrocyte lysis buffers along with ctab extraction buffer were used for dna extraction. the quantity and purity of the extracted dna were assessed through absorbance measurements at a260/280 and a260/230 ratios. dna integrity was evaluated using agarose gel electrophoresis. the consistency of buffer performance was analyzed using the coefficient of variance (cv%) for dna quantity. also, the efficiency of pcr was reported by checking the cycle threshold (ct) in qpcr for each sample using the linear regression equation and coefficient of determination (r2) in graphpad prism v10 software. differences were considered significant at the p>0.05 level.results: the lysis buffer with the combination of 10 mm tris-hcl ph 7.6 and 10 mm kcl resulted in the extraction of the highest amount of dna (361.01 ng/µl). the results of the gel did not show any fragmentation of dna in the samples. absorption ratios did not show much difference between buffers. dna extracted using a lysis buffer containing 155 mm nh4cl, 10 mm khco3, 5 mm edta showed lower variance in dna quantity (cv = 7.6%) and better pcr efficiency (efficiency = 103%, r2 = 99.7%) for 36b4 and (efficiency = 99%, r2 = 99.6%) for telomeres compared to other buffers.conclusion: the lysis buffer containing 155 mm nh4cl, 10 mm khco3, and 5 mm edta had the most effective performance in extracting dna from frozen blood samples for telomere study. this buffer with its optimal performance can be used in trials after the final result by further studies.