مهندسی آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس در موقعیت279 با استفاده از جهش زایی هدفدار برای بهبود پایداری

آنزیم اوریکاز یا اورات اکسیداز جزء دسته اکسیدازهای بدون کوفاکتور می باشد. آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس باعث کاتالیز اسیداوریک به 5-هیدروکسی ایزواورات وهیدروژن پراکسید میشود که در نهایت این ترکیب طی واکنش غیر آنزیمی به یک ترکیب قابل دفع به نام آلانتوئین تبدیل می شود. اوریکاز یک آنزیم اصلی در تجزیه نوکلئوتیدهای پورینی می باشد. این آنزیم توزیع گسترده ای درمیان میکروارگانیسم ها دارد اما انسان ها وتعدادی از نخستی های عالی به علت جهش های بی معنی در دوره میوسن این آنزیم را از دست داده اند. هدف این مطالعه جایگزینی اسید آمینه آلانین در موقعیت279 به سیستئین جهت بررسی پایداری آنزیم اوریکاز می باشد. برای بررسی این موضوع از مطالعات بیوانفورماتیکی از قبیل سرورهایi-mutant ، i-stable استفاده کردیم. در این تحقیق از پلاسمید pet28a(+)حاوی ژن اوریکاز وباکتریe.coli سویه bl21 مورد استفاده قرار گرفت. جهش زایی هدفدار به روش quick-change pcr به منظور ایجاد جهش نقطه ای با استفاده از pfu dna polymeras انجام شد و از کروماتوگرافی میل ترکیبی ni-nta برای تخلیص پروتئین استفاده شد. پس از خالص سازی، دمای بهینه 25، 25 و همچنین ph بهینه 8، 9 به ترتیب برای آنزیم جهش یافته و وحشی به دست آمد. همچنین پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته در دماهای 40، 50 و 60 درجه سانتی گراد تقریبا 80 درصد فعالیت خود را از دست داده است. بنابراین به منظور پایدارسازی آنزیم های دارویی، از روش جهش زایی هدفدار می توان استفاده کرد.

engineering of aspergillus flavus uricase enzyme at position 279 using site-directed mutagenesis for improving thermostability

uricase enzyme or urate oxidase is one of the oxidases without cofactors the uricase enzyme of aspergillus flavus catalyzes uric acid into 5-hydroxyisoaurate and hydrogen peroxide, and finally this compound is converted into a removable compound called allantoin through a non-enzymatic reaction. uricase is a main enzyme in the breakdown of purine nucleotides. this enzyme is widely distributed among microorganisms, but humans and higher primates have lost this enzyme due to nonsense mutations in the miocene period. the aim of this study is to replace the amino acid alanine at position 279 with cysteine ​​to check the stability of uricase enzyme. to investigate this issue, we used bioinformatics studies such as i-mutant and i-stable serves. servers. in this research, plasmid pet28a(+) containing uricase gene and e.coli strain bl21 was used. targeted mutagenesis was done by quick-change pcr method to create point mutation using pfu dna polymerase. ni-nta affinity chromatography was used for protein purification. after purification, the optimal temperature of 25, 25 and also optimal ph of 8, 9 were obtained for the mutant and wild enzyme respectively. also, the thermal stability of the mutant enzyme has lost almost 80% of its activity at temperatures of 40, 50, and 60 °c . therefore, in order to stabilize medicinal enzymes, targeted mutagenesis can be used.