کلونینگ مولکولی، بیان و خالص سازی ژن اندولیزین kp27 فاژ کلبسیلا در ناقل pet28a

اندولیزین‌ها، آنزیم‌های قدرتمندی از باکتریوفاژها هستند که دیواره‌ی سلولی باکتری‌ها را تخریب می‌کنند و به عنوان عوامل ضدمیکروبی موثر به دلیل اختصاصیت بالای خود شناخته می‌شوند. آن‌ها به طور انتخابی پاتوژن‌ها را هدف قرار می‌دهند بدون اینکه میکروفلورای مفید را تحت تاثیر قرار دهند و در برابر باکتری‌های گرم‌مثبت و گرم‌منفی موثر هستند. اندولیزینkp27، یک پروتئین مقاوم به حرارت از باکتریوفاژ kp27، پتانسیل بالایی در مقابله با کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چندین دارو نشان می‌دهد. این مطالعه بر روی کلونینگ، بیان، و خالص‌سازی اندولیزین kp27 تمرکز دارد. در این مطالعه از ژن kp27، پرایمرهای اختصاصی، مواد pcr (taqپلی‌مراز،dntpها، mgcl2، بافر) و یک وکتور پلاسمیدی pet28a استفاده شد، آنزیم‌های محدودکننده ncoi) و (xhoi، t4 dna ligase، و سلول‌های مستعد e.coli (dh5α) به کار گرفته شدند و پلیت‌های lb آگار حاوی کانامایسین برای انتخاب کلنی استفاده شدند. پرایمرهایی با مکان‌های مربوط به آنزیم محدودکننده طراحی شده و ژن kp27 توسط pcr تکثیر شد. برای کلونینگ، پس از تایید محصول pcr توسط ژل الکتروفورز، محصول را خالص‌سازی کرده و سپس به همراه وکتور مربوطه، توسط آنزیم محدود کننده هضم شد. در مرحله بعد، ژن با آنزیم t4 dna ligase درون وکتور متصل شده و به سلول‌های e. coli dh5α منتقل شد. پس از آن، کلنی‌ها با pcr غربالگری شده، سپس پلاسمید مینی‌پرپ شده و در نهایت توسط توالی‌یابی تایید شدند. برای بیان پروتئین، ابتدا پلاسمید به سلول‌هایe.coli bl21(de3) منتقل شد و سپس بیان پروتئین با 0.1 میلی‌مولار iptg در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 8 ساعت القا شد. پس از آن، سلول‌ها برداشت، لیز، و توسط sds-page 15% آنالیز شدند تا بیان آن مورد بررسی قرار بگیرد. در نهایت، لیزات روی ستون ni²⁺-nta بارگذاری شده و kp27 خالص‌شده با غلظت 1.5 میلی‌گرم/میلی‌لیتر به دست آمد. اندولیزین kp27 با موفقیت کلون، بیان، و خالص‌سازی شد و به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی‌بیوتیک‌های سنتی و مناسب برای مطالعات بیشتر معرفی شد.

molecular cloning, expression, and purification of the klebsiella phage endolysin kp27 gene in the pet28a vector

endolysins, powerful enzymes from bacteriophages, degrade bacterial cell walls and are promising antimicrobial agents due to their high specificity. they selectively target pathogens without harming beneficial microflora and are effective against both gram-positive and gram-negative bacteria. the kp27 endolysin, a heat-stable protein from bacteriophage kp27, shows potential against multidrug-resistant klebsiella pneumoniae. this study focuses on cloning, over-expressing, and purifying kp27 endolysin. kp27 gene, specific primers, pcr reagents (taq polymerase, dntps, mgcl2, buffer), and a pet28a plasmid vector were employed. restriction enzymes (ncoi and xhoi), t4 dna ligase, and competent e. coli cells (e.g., dh5α) are used, with lb agar plates containing kanamycin for selection. primers with restriction sites are designed, and the kp27 gene is amplified by pcr. for cloning, once the pcr product was confirmed by gel electrophoresis, it was purified and then digested along with the vector. next, the gene ligated into the vector with t4 dna ligase and transformed into e. coli dh5α cells. afterward, colonies were screened by pcr, then plasmid minipreped, and eventually verified by sequencing. for protein expression, the first plasmid is transformed into e. coli bl21(de3) cells, and later protein expression is induced by 0.1 mm iptg at 37°c for 8 hours. after that, cells were harvested, lysed, and analyzed by sds-page 15% to confirm overexpression. finally, lysate was loaded on a ni²⁺-nta column, and purified kp27 obtained at the concentration of 1.5mg/ml. the kp27 endolysin was successfully cloned, expressed, and purified, providing a viable alternative to traditional antibiotics and suitable for further studies.