نقش بیان نوترکیب آسپارتات سمی آلدئید دهیدروژناز بر میزان ترشح ترئونین

ترئونین یکی از اسیدهای آمینه ضروری در پستانداران بوده که در زیست فناوری نیز این اسید آمینه نقش محوری در صنایع دارویی، غذایی و به ویژه خوراک دام ایفا می­کند. امروزه در صنعت از سویه های دست ورزی شده اشرشیا کولی جهت تولید این اسید آمینه مهم استفاده می شود. مسیر بیوسنتز این اسید آمینه از آسپارتات شامل پنج مرحله آنزیمی است که یکی از کلیدی‌ترین آن‌ها، آنزیم آسپارتات سمی آلدهید دهیدروژناز است. در این پژوهش، ابتدا با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی پرایمرهایی اختصاصی ژن asd به همراه جایگاه برش آنزیم های محدود کننده مورد نظر طراحی و سفارش داده شد. در مرحله بعد ژن آنزیم از طریق pcr تکثیر گردید و پس از هضم آنزیمی و لیگاسیون وارد وکتور بیانی pet-21a گردید. پس از آن، سلول‌های مستعد escherichia coli توسط پلاسمید نوترکیب تهیه شده تراریخت گردید. در نهایت میزان ترئونین در محیط کشت فقیر به روش نین هیدرین اندازه‌گیری گردید و میزان ترئونین تولیدی با سلول‌های بدون پلاسمید مقایسه شد. نتایج نشانگر این هستند که از محیط کشت انتخابی lb، m9 و 2x بیان پروتین مربوطه پس از گذشت 12 ساعت محیط کشت 2x بهترین عملکرد را از خود نشان داده و نتایج تست نین هیدرین بیانگر افزایش غلظت از 2/0 به 35/2 میلی­گرم بر میلی­لیتر است. در این راستا نتایج به‌دست‌آمده با مطالعات قبلی مقایسه شد و پیشنهاد می‌شود سایر ژن‌های مسیر بیوسنتز نیز با همین روش بررسی شوند. همچنین مهندسی پروتئین هر یک از آنزیم‌های مسیر و تغییر اجزای محیط کشت می‌تواند به افزایش فعالیت کمک کند.

role of recombinant expression of aspartate semialdehyde dehydrogenase in threonine production

threonine is one of the essential amino acids in mammals, playing a pivotal role in biotechnology, particularly in pharmaceutical, food, and poultry nutrition. nowadays, engineered strains of escherichia coli are utilized in the industry to produce this important amino acid. the biosynthetic pathway of threonine from aspartate consists of five enzymatic steps, one of the key enzymes being aspartate semialdehyde dehydrogenase. in this study, specific primers for the asd gene were designed along with the restriction sites using bioinformatics tools and ordered, subsequently, the enzyme gene was amplified via pcr and, after enzymatic digestion and ligation, introduced into the expression vector pet-21a. thereafter, competent escherichia coli cells were transformed with the recombinant plasmid. finally, the threonine content in the minimal medium was measured using the ninhydrin method, and the produced threonine levels were compared with those of plasmid-free cells. the results indicate that among the selected lb, m9, and 2x media, the expression of the corresponding protein showed the best performance after 12 hours at 37°c in the 2x medium. moreover, the results of the ninhydrin test indicate that the concentration of threonine has increased from 0.2 to 2.35 mg/ml. in this context, the obtained results were compared with previous studies, and it is suggested that other genes in the biosynthetic pathway be investigated using the same methodology. furthermore, protein engineering of each enzyme in the pathway and modification of culture medium components could enhance activity.