ارزیابی بیوانفورماتیکی پروتئین اگزوتوکسین a سودوموناس آئروژینوزا و بیان دگرساخت آن در اشریشیا کلی

اگزوتوکسینa یکی از فاکتورهای بیماری‌زای سودوموناس آئروژینوزا می­باشد که دارای فعالیت آنزیمی adp ریبوزیل ترانسفراز بوده و با غیرفعال کردن فاکتور2 افزایش طول پروتئین در سلول‌های یوکاریوتی (eef2)، سنتز پروتئین را مهار و منجر به القای مرگ سلول هدف می­­شود. از این­رو اگزوتوکسینa به عنوان نامزد در درمان سرطان شناخته می­شود. هدف از این مطالعه، تولید دگرساخت اگزوتوکسینa با استفاده از ناقل بیانی pet-28a می­باشد. در این پژوهش، ابتدا توالی ژن و پروتئین اگزوتوکسینa، میزان سمیت، ایمنی­زایی و اپی­توپ­های مرتبط با سلول­های لنفوسیت b وt ، توسط ابزارهای بیوانفورماتیک مطالعه شدند. در نهایت برای تولید پروتئین دگرساخت، در یک واکنش زنجیره­ای پلیمراز، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن اگزوتوکسینa از باکتری سودوموناس آئروژینوزا (atcc27853) جداسازی و در ناقل بیانی pet-28a همسانه­­سازی گردید. با کمک هضم آنزیمی و توالی یابی سازه حاصل، phb6، حضور ژن اگزوتوکسینa به طول 1900 جفت باز به اثبات رسید. phb6 در سلول اشریشیا‌کلی(bl21) با استفاده از القاءگر iptg بیان شد. پروتئین دگرساخت بوسیله ستون کروماتوگرافی ‌تمایلی‌ نیکل‌-آگارز‌ تخلیص و به کمک sds-page 12%، وزن مولکولی پروتئین بدست آمد. پروتئین ایمنی­زای اگزوتوکسین a با وزن مولکولی 69 کیلودالتون، متشکل از سه دومین­ اتصال، انتقال به سلول هدف و کاتالیتیکی است که با میانگین کل هیدروپاتیک منفی، یک مولکول قطبی­ می­باشد. وجود 28.21% مارپیچ آلفا در ساختار ثانویه به عبور پروتئین از عرض غشا و پایداری آن کمک می­کند. بهینه­سازی شدت بیان اگزوتوکسینa در زمان و غلظت­های متفاوت القاگرiptg نشان داد که بیشترین بیان در غلظت 1 میلی­مولار به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس صورت می‌گیرد. مطالعه برروی عملکرد پروتئین دگرساخت در حال انجام است.

bioinformatics’ evaluation of exotoxin a from pseudomonas aeruginosa and its heterologous expression in escherichia coli

exotoxin a is a key virulence factor from pseudomonas aeruginosa. it is an adp-ribosyl-transferase that inhibits protein synthesis by inactivating the eukaryotic elongation factor 2 (eef2), leading to apoptosis and cell death. therefore, exotoxin potentially is a novel treatment approach in cancer therapy. this study evaluated exotoxin a s gene and protein sequence, toxicity, immunogenicity, and epitopes related to b and t lymphocytes using bioinformatics tools. the exotoxin a gene was isolated by pcr using specific primers and inserted into the pet28a, generating phb6. sequencing and enzymatic digestion confirmed the 1900 bp exotoxin a gene in phb6. subsequently, the heterologous protein was produced in escherichia coli (bl21de3). the heterologous exotoxin was purified using a nickel-affinity chromatography column and surveyed on 12% sds-page. the exotoxin a is found to be a polar molecule with an overall negative hydropathicity of 69 kda and consists of three domains: binding, translocation to the target cell, and catalytic. its secondary structure includes 28.21% alpha-helices, contributing to membrane translocation and stability. the results for optimization for heterologous expression of exotoxin a showed the highest expression applying 1 mm iptg for 4 hours at 37 °c. the study of the heterologous protein function is under processing.