طراحی و تولید سازه نوترکیب پروتئین Tat و بخش عملکردی سم دیفتریا و ارزیابی عملکرد آن بر روی لاین سلولی

زمینه و هدف: سرطان، یکی از مهلک ترین بیماری هایی است که در عصر حاضر وجود دارد و درمان های مرسوم به آن نیز دارای موفقیت کمی بوده است. توکسین درمانی سرطان، از روش های درمانی نوینی است که موردتوجه متخصصان ساخت دارو قرار گرفته است. توکسین باکتری دیفتری شامل: سه بخش عملکردی، انتقال دهنده و اتصال دهنده بوده که بخش عملکردی آن باعث مهار سنتز پروتئین و مرگ سلول می شود. این مطالعه با هدف تولید بخش عملکردی توکسین دیفتری به همراه پپتید نفوذکننده tat و بررسی میزان کشندگی آن بر روی لاین سلولی صورت گرفت.روش بررسی: در این مطالعه، طراحی پرایمر برای قطعه ژنی tatdiph انجام شد و سازه ژنی حاوی توالی زنجیره عملکردی توکسین دیفتری و توالی پپتید tat، تکثیر و در ناقل بیانی پروکاریوت،a 28pet حاوی دنباله هیستیدین کلون گردید. بعد از انتقال به میزبان باکتریایی (e.coli de 21 bl 3)، القای بیان با iptg صورت گرفت. سپس پروتئین حاصل تخلیص شد و پروتئین نوترکیب با کمک آنتی بادی ضد هیستیدین متصل به hrp با استفاده از تکنیک وسترن بلات تایید گردید. در مرحله بعد، میزان کشندگی پروتئین کایمریک تولیدشده بر روی رده سلولی 7mcf با روش mtt مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته ها: نتایج حاصل از mtt نشان داد پروتئین نوترکیب tatdiph می تواند رده سلولی سرطانی 7mcf را از بین ببرد.نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد پروتئین نوترکیب با بخش عملکردی توکسین دیفتری و پپتید tat، می تواند بر روی رده سلولی 7mcf اثر کشندگی داشته باشد.

Design and Production of Recombinant TAT Protein Structure, Catalytic Domain of Diphtheria Toxin, and Evaluation of Its Effect on Cell Line

Background and Objectives: Cancer is one of the most deadly diseases in the present age and its conventional therapies have had low success. Toxin therapy of cancer is a new therapeutic approach, which has attracted the attention of pharmaceutical specialists. Diphtheria toxin consists of three functional, transducing, and binding domains, that the functional part inhibits protein synthesis and causes cell death. The purpose of this study was to produce the functional domain of the diphtheria toxin fused with a TAT penetrating peptide and to investigate its degree of lethality on cell line. Methods: In this study, primer was designed for tatdiph gene and the gene construct containing the sequence of the functional chain of diphtheria toxin and the TAT peptide sequence, were amplified and cloned into prokaryotic expression vector pET28a containing a sequence of histidine. After transferring into bacterial host (E. coli BL21 DE3), induction of expression was performed using IPTG, then, the resulting protein was purified and the protein expression was confirmed by antihistidine antibody attached to horseradish peroxidase (HRP) using western blotting technique. In the next step, the lethality of the produced chimeric protein, was evaluated on MCF7 cell line by MTT assay. Data were analyzed by uni pirate and oligo 6 software. Results: The results of MTT assay indicated that the TATDiph recombinant protein adjacent to the MCF7 cell line increased the rate of mortality of the cells. Conclusion: The results of this study revealed that the recombinant protein with functional domain of diphtheria toxin and AT peptide could have lethal effect on MCF7 cell line.