همسانه سازی، بهینه سازی شرایط بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب nef-mper-v3 ویروس hiv-1 در سیستم بیانی پروکاریوتی

مقدمه: پروتئین تنظیمی nef و همچنین پروتئین های ساختاری mper و v3 ویروسhiv از اهداف مهم در مطالعات واکسن بشمار می روند. لذا در مطالعه حاضر، پروتئین فیوژن nef-mper-v3 در سیستم بیانی پروکاریوتی کلون، بیان شد تا به عنوان کاندید مناسب در مطالعات آتی واکسن مورد ارزیابی قرار گیرد.روش کار: توالی ژن nef-mper-v3 سنتز و توسط آنزیم های noti /hindiii به داخل وکتور pet-28a کلون شد. سپس، بیان پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی bl21(de3) انجام شد. به منظور بهینه سازی بیان، فاکتورهایی نظیر زمان القاء، غلظت iptg و دانسیته نوری (od) مورد ارزیابی قرار گرفت. پروتئ میزان بیان توسط الکتروفورز sds-page تعیین گردید. سپس، پروتئین با استفاده از ستون ninta agarose تخلیص شد و نهایتا، توسط وسترن بلات تعیین هویت و تایید شد.یافته ها: ژن هدف با موفقیت در وکتور بیانی کلون و پس از انتخاب بهترین شرایط بیان شامل: غلظت 2 میلی مولار iptg درکدورت نوری7/0od600nm= و بمدت پنج ساعت پس از القاء، پروتئین بیان شده بوسیله کروماتوگرافی تمایلی تحت شرایط دناتوره و با استفاده از اوره با غلظت حدود 300 میکروگرم در میلی لیتر تخلیص شد. پروتئین فیوژن تخلیص شده بصورت یک باند واضح حدود 35 کیلودالتون در sdspage مشاهده شد و با استفاده از آنتی بادی ضد nef در وسترن بلات آشکار شد. نتیجه گیری: نتایج ما نشان داد که پروتئین نوترکیب nefmperv3 در سیستم بیانی bl21 (de3) بخوبی بیان شده و پروتئین تخلیص شده قابلیت استفاده در آزمایشات آتی به منظور ارزیابی ایمنوژنسیتی آن در موش که در حال انجام می باشد را دارد.

Cloning, Optimization of Expression Condition and Purification of the Recombinant Nef- MPER-V3 Protein of HIV-1 in Prokaryotic Expression System

Background: Nef regulatory protein as well as structural proteins MPER and V3 of HIV1 is important targets in vaccine studies. Therefore, in the current study, the NefMPERV3 fusion protein was cloned and expressed in prokaryotic expression system that will be considered as a candidate for future vaccine studies.Materials and Methods: The NefMPERV3 sequence was synthesized and inserted into pET28a(+) vector using NotI/HindIII enzymes. Then, the recombinant construct was expressed in BL21 (DE3) strain of E.coli. Several factors including time course, IPTG concentration and optical density (OD) were evaluated for optimization of protein expression. The protein expression was purified on a NiNTA agarose column and analyzed by 12% SDSPAGE. Finally, the fusion protein was identified and confirmed by western blotting.Results: The target gene was cloned successfully into the recombinant vector and after selection of the best condition for the protein expression such as; 2 mM of IPTG, OD= 0.7 at 600nm and 5 hours after induction, purification of the recombinant protein by affinity chromatography in denaturing condition by urea yielded about 300 micro;g/ mL. The purified fusion protein migrated as a clear band of around 35 kDa in SDSPAGE and was detectable using antiNef antibody in western blotting.Conclusion: Our results showed that the NefMPERV3 protein was successfully expressed in prokaryotic system and purified protein may provide the antigen for future experiments for immunogenicity evaluation in mice are currently undertaken.