همسانه‌سازی، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت اندولیزین فاژ kp27 کلبسیلا پنومونیه در سیستم بیانی pet28a(+)

زمینه و هدف: اندولیزین فاژ kp27 پروتئینی با جرم مولکولی 14/7 کیلو دالتون است که دارای فعالیت اندوپپتیدازی علیه دیواره سلولی باکتری ها می ‌باشد. به‌دلیل وجود تحقیقات محدود روی اندولیزین kp27 و همچنین برتری آن در برابر شرایط محیطی سخت مثل دما و ph هدف از این مطالعه تولید نوترکیب و بررسی فعالیت ضدباکتریایی آن علیه دو باکتری گرم منفی و مثبت اشرشیاکلی و استافیلوکوک اورئوس می‌ باشد.روش‌ها: ژن اندولیزین kp27 بین دو آنزیم محدود کننده ncoi و xhoi در پلاسمید pet 28a(+) همسانه سازی شد. تولید در باکتری e. coli bl21 (de3) و تخلیص توسط کروماتوگرافی ni2+ nta سفاروز انجام شد. جهت بررسی فعالیت ضدباکتری اندولیزین از تست های فعالیت باکتری کشی، mic، mbc و فعالیت آنزیمی از تخریب دیواره سلولی استفاده شد. آنالیز آماری و رسم نمودارها توسط نرم افزار گراف پد پریسم انجام شد.یافته‌ها: اندولیزین kp27 با موفقیت همسانه سازی و با راندمان بالا به مقدار 28/5 میلی‌گرم/لیتر محیط کشت تولید شد. میزان کشندگی آن علیه باکتری های اشرشیاکلی و استافیلوکوک اورئوس در غلظت های بالاتر از 4 ماکروگرم/لیتر بیشتر از 50 درصد بود. میزان mic و mbc آن به ترتیب  16 و 64 ماکروگرم/لیتر برای اشرشیاکلی و 8 و 32 ماکروگرم/لیتر برای استافیلوکوک اورئوس به دست آمد. بررسی فعالیت تخریب دیواره سلولی اندولیزین حاکی از کاهش 20 درصد کدورت محلول پس از نیم ساعت مجاورت با اندولیزین بود. نتیجه‌گیری: باتوجه‌به مقدار بیان و تولید بالای اندولیزین kp27 و همچنین فعالیت بالای آن در برابر دو باکتری گرم منفی و گرم مثبت مورد مطالعه، می توان آن را گزینه مناسبی برای پژوهش های کاربردی و متعاقب آن صنعتی شدن به جای آنتی‌بیوتیک‌ها پیشنهاد داد.

cloning, expression, purification and investigation of activity of klebsiella pneumoniae phage kp27 endolysin

background and aim: endolysin of phage kp27 is a protein with a molecular mass of 14.7 kda, which has endopeptidase activity against bacterial cell walls. due to limited research on endolysin kp27 and its superiority against harsh environmental conditions such as temperature and ph, the aim of this study is recombinant production and investigation of its antibacterial activity against two gram negative and positive bacteriamethods: kp27 endolysin gene was cloned between two restriction enzymes ncoi and xhoi in plasmid pet 28a(+). e. coli bl21 (de3) was used for expression and production and purification was performed by ni2+ nta sepharose chromatography. bactericidal activity tests, mic and mbc against escherichia coli and staphylococcus aureus bacteria and cell wall degradation were used to investigate the antibacterial and enzymatic activities of endolysin, respectively. statistical analysis and generation of graphs were achieved by graphpad prism software.results: endolysin kp27 was successfully cloned and produced with high efficiency in the amount of 28.5 mg/l of culture medium. bactericidal activity against escherichia coli and staphylococcus aureus bacteria was over 50% at the concentrations of 4 µg/ml. for escherichia coli, mic and mbc were calculated 16 and 64 µg/ml while for  staphylococcus aureus they were 8 and 32 µg/ml, respectively. evaluating the cell wall degradation activity of endolysin indicated a 20% decrease in the turbidity of the solution after half an hour incubation with endolysin.conclusion: considering the high expression and production as well as its high activity against both gram negative and gram positive bacteria, endolysin kp27 can be suggested as a convenient candidate for further applied research and subsequent industrialization instead of antibiotics.