طراحی سازه بیانی حاوی ژن دیس اینتگرین شناسایی شده از ترانسکریپتوم عقرب همیسکورپیوس لپتوروس و بررسی عملکرد آن در مدل برون تنی

زمینه و هدف: چسبندگی سلول نقش مهمی در تهاجم سلول های سرطانی ایفا می کند. دیس ‌اینتگرین ها ابزار درمانی مناسبی برای سرطان محسوب می گردند. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن دیس ‌اینتگرین شناسایی شده از ترانسکریپتوم زهر عقرب همیسکورپیوس لپتوروس در میزبان باکتریایی و بررسی عملکرد آن در مدل برون ‌تنی می‌ باشد.روش‌ها: در ابتدا ساختارهای اول، دوم و سوم پروتئین دیس اینتگرین با استفاده از ابزار بیوانفورماتیک مورد بررسی قرار گرفت. سپس ژن سنتز و در وکتور pet-22b کلون شد. سازه بدست آمده به میزبان باکتری اشریشیا کلای bl-21 ترانسفورم شد. بیان پروتئین توسط نیم میلی مولار ایزوپروپیل-بتا-d-تیوگالاکتوپیرانوسید القا شد. بیان با استفاده از ژل سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید و وسترن بلات بررسی و تایید شد. پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی نیکل در شرایط دناتوره خالص‌ سازی شد. پس از خالص‌سازی، پروتئین با حذف تدریجی اوره از طریق دیالیز دوباره تا شد. پس از بیان پروتئین و خالص سازی، اثر مهاری دیس اینتگرین بر بقا و مهاجرت رده‌ های سلولی huvec به ترتیب با استفاده از روش mtt و transwell مورد بررسی قرار گرفت.یافته‌ها: نتایج تجزیه و تحلیل ساختاری نشان داد که ساختار پیش‌بینی‌شده دیس‌ اینتگرین ویژگی‌های معمولی را نشان می‌دهد و با الگوهای ساختاری مورد انتظار مشاهده‌شده در پروتئین‌های دیس‌اینتگرین مطابقت دارد. بالاترین سطح بیان پروتئین با غلظت ایزوپروپیل-بتا-d-تیوگالاکتوپیرانوسید 0/5 میلی مولار و انکوباسیون 5 ساعته مشاهده شد. وزن مولکولی پروتئین بیان شده تقریباً 12 کیلو دالتون بود. دیس اینتگرین رشد سلول های huvec را با 50 ic37 میکروگرم در میلی لیتر پس از یک دوره انکوباسیون 48 ساعته مهار کرد. علاوه بر این، دیس اینتگرین خالص شده، مهاجرت 70 درصد از سلول‌های huvec را به سمت منبع فاکتور رشد اندوتلیای عروقی، در مقایسه با گروه کنترل بدون دیس‌ اینتگرین، مهار کرد.نتیجه‌گیری: نتایج حاکی از پتانسیل دیس اینتگرین در مهار رشد و مهاجرت سلولهای اندوتلیال انسان می باشد.

designing an expression construct containing the disintegrin gene identified from the transcriptome of the scorpion hemiscorpius lepturus and evaluation of its function in an in vitro model

background and aim: cell adhesion plays an important role in the invasion of cancer cells. disintegrins are considered a suitable therapeutic tool for cancer. this study aims to clone and express the disintegrin gene identified from the transcriptome of hemiscorpius lepturus scorpion venom in a bacterial host and to investigate its function in an in vitro model.  methods: initially, the first, second and third structures of disintegrin protein were investigated using bioinformatics tools. then, the gene was synthesized and cloned into pet-22b vector. the resulting construct was transformed into e.coli bl-21 bacterial host. the protein expression was induced by 0.5mm isopropyl beta d thiogalactopyranoside. the expression was checked and confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel and western blot. the protein was purified using nickel affinity chromatography under denaturing conditions. following purification, the protein was refolded by gradually removing urea through dialysis. after protein expression and purification, the inhibitory effect of disintegrin on the survival and migration of huvec cell lines was investigated using mtt and transwell assay, respectively.results: the results of structural analysis showed that the predicted disintegrin structure exhibits typical characteristics and conforms to expected structural patterns observed in disintegrin proteins. the highest level of protein expression was observed with isopropyl beta d thiogalactopyranoside concentration of 0.5mm and 5 hour incubation. the molecular weight of the expressed protein was approximately 12 kda. the disintegrin inhibited the growth of huvec cells with an ic50 of 37 µg/ml after a 48 hour incubation period. furthermore, the purified disintegrin inhibited the migration of 70% of huvec cells towards the vascular endothelia growth factor source, compared to the control group without disintegrin.conclusion: these findings demonstrate the potential of the disintegrin identified from the transcriptome of the scorpion hemiscorpius lepturus to inhibit the growth and migration of huvec cells.