بهینه‌ سازی شرایط کشت درون شیشه‌ای زالزالک خونین (crataegus atrosanguinea)

مقدمه و هدف: پژوهش در زمینه حفاظت از ژرم‌ پلاسم گونه‌های درختی بومی و دارویی جنگل‌های شمال ایران به ‌ویژه زالزالک خونین با خواص دارویی فراوان، دارای اهمیت است. تکثیر جنسی زالزالک به دلایل پوسته ضخیم و دو نوع خفتگی فیزیکی و فیزیولوژیک به‌سختی و با آپومیکسی امکان‌پذیر است و تکثیر غیرجنسی آن از راه ریشه‌دار کردن قلمه نیز با مشکلات فراوانی مواجه است. زالزالک خونین (crataegus atrosanguinea) از خانواده rosaceae یکی از گونه‌های با ارزش جنگل‌های شمال و غرب کشور محسوب می‌شود که به‎‌دلیل مثمر بودن و داشتن چوب بسیار محکم و خواص دارویی متعدد دارای اهمیت فراوان است. خواص دارویی زالزالک در درمان فشار خون، تصلب شرائین و احتقان قلب، ضعف عضلات قلب و نارسایی کرونر به اثبات رسیده است. زالزالک حاوی متابولیت‌های ثانویه فراوان مانند فلاونوئیدها و پروآنتوسیانیدین و گیلکوزیدها است. بهینه‌سازی شرایط کشت درون شیشه‌ای زالزالک خونین به‌عنوان یکی از گونه‌های طبیعی ایران می‌تواند راهکار مناسبی برای تکثیر آن باشد. پژوهش حاضر با هدف کنترل آلودگی، کنترل قهوه‌ای‌شدن و القای کالوس زالزالک خونین (crataegus atrosanguinea) در شرایط درون شیشه‌ای انجام شد. کنترل آلودگی ریزنمونه، بذر و بافت گیاهان از اهمیت بالایی برای موفقیت کشت بافت گیاهان محسوب می‌شود. از آنجا که پرآوری از ریزنمونه‌های طبیعی گیاهان برای کشت بافت در اولویت قرار دارد، معمولاً این مهم با قهوه‌ای شدن به‌ویژه برای گیاهان چوبی که دارای ساقه ضخیم و چوبی هستند با مشکلات فراوانی همراه است. تعیین نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد به‎عنوان یک عامل متغیر برای رشد گیاهان در شرایط درون شیشه‌ای ضروری است. بعد از اعمال تنظیم‌کننده رشد به محیط کشت، گیاه واکنش‌های مختلفی نشان خواهد داد اما یکی از راه‌های مناسب برای انتخاب مسیر صحیح باززایی گیاهان، تعیین وزن تر و خشک کالوس است که به‎طور گسترده به‌عنوان معیاری از رشد کالوس‌ها مورد اندازه‎گیری قرار می‎گیرد. با استفاده از وزن تر و خشک کالوس می‌توان منحنی رشد کالوس را به‌دست آورد. نتایج پژوهش‌های گذشته حاکی از دامنه وسیع تغییرات نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد بر کالوس‌زایی و باززایی گونه‌های مختلف جنس زالزالک است و متناسب با نوع گونه گیاهی باید نوع و غلظت خاصی از تنظیم‌کننده‌های رشد را اعمال کرد. مواد و روش‌ها: ساقه‌های جوان و سالم زالزالک‎ خونین از لاریجان آمل، استان مازندران، ایران با مختصات جغرافیایی ’38° 58 شمالی و ’10° 52 شرقی در ابتدای فصل رویش جمع‌آوری شد. ساقه‌های جمع‌آوری شده بلافاصله به آزمایشگاه کشت بافت گیاهی دانشکده منابع طبیعی در دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران منتقل شدند. ضدعفونی ساقه‌های طبیعی زالزالک به‎دلیل آلودگی سطحی و بافتی فراوان بسیار ضروری است. برای این‎منظور از ساقه‌ها ریزنمونه‌هایی به اندازه 0/5 تا یک سانتی‌متری برش داده شدند. تیمارهای کنترل آلودگی شامل hgcl2، h2o2، naclo و agno3 و همچنین برای کنترل قهوه‌ای شدن ریزنمونه‌ها پنج تیمار طراحی شد. تیمارهای کنترل قهوه‌ای شدن شامل شاهد، آب روان، اسیداسکوربیک، پلی‌وینیل‌کلراید و ذغال فعال بود. به‌طور کلی محیط ‌کشت از موادی شامل نمک‌های معدنی (عناصر کم مصرف و پر مصرف) به‌عنوان تامین کننده رشد بیشینه، اسیدهای آمینه و ویتامین‌ها به‎عنوان نیتروژن، قند به‎عنوان منبع کربن و انرژی، تنظیم‌کننده‌های رشد به‎عنوان محرک رشد و ریخت‌زایی، آگار به‎عنوان جامد کننده محیط‌ کشت و آب که 90 درصد محیط‌ کشت را شامل می‌شود، تشکیل می‌گردد. محیط‌کشت به‎کار رفته در این تحقیق ms بود که اولین بار توسط درایور و کنیاکی در سال 1984 ساخته شد و با در نظر گرفتن روش دوفوسارد1976 تهیه شد. در این پژوهش ph محیط کشت روی 5/8 تنظیم گردید. برای القای کالوس، تیمارهای iba، naa، 2,4-d، bap، tdz و kin در سه سطح غلظت 0/1، 1 و 6 میلی‌گرم در لیتر و ترکیب 6 mgl-1 naa+1 mgl-1 bap و 6 mgl-1 iba+1 mgl-1 bap در محیط کشت ms استفاده شد. در این مطالعه ریزنمونه‌های ساقه به‎صورت افقی روی محیط‌کشت قرار گرفتند. از بین تیمار‌های مختلف کالوس‌زایی برای بررسی القای کالوس، درصد کالوس‌زایی، درجه کالوس‌زایی، وزن تر و خشک کالوس و مساحت سطح مقطع کالوس اندازه‌گیری شد. بهترین تیمار از طریق محاسبه مشخصه‌های مذکور به‌دست آمد و برای واکشت از آن تیمار استفاده می‌شد. به‌طور تقریبی هر 20 روز و در مجموع پنج الی شش بار واکشت انجام گرفت. بعد از کشت کالوس‌ها در محیط باززایی، ریزنمونه‌ها در اتاقک کشت و قفسه‌های سازگاری تحت تیمار 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2± 25 درجه سانتی‌گراد با رطوبت 70 درصد قرار گرفتند. یافته‌ها: نتایج نشان داد که hgcl2 (0/5 درصد، 16 دقیقه) با میانگین 100 درصد سلامت به‌عنوان مناسب‌ترین تیمار کنترل آلودگی بود. تیمار شاهد با 98 درصد سلامت به‌عنوان مناسب‌ترین تیمار کنترل قهوه‌ای‌شدن مشاهده شد. همچنین نتایج نشان داد که نوع، غلظت و اثر متقابل نوع و غلظت تنظیم‌کننده رشد بر مشخصه‌های القای کالوس زالزالک خونین اثر معنی‌داری دارد (p<0.01). بیشترین وزن تر و خشک کالوس، درصد و درجه کالوس‌زایی و سطح مقطع کالوس در بین تیمارهای اکسین و سیتوکنین به‌ترتیب برای تیمارهای 6 میلی‌گرم در لیتر naa و تیمار 1 میلی‌گرم در لیتر bap مشاهده شد. همچنین نتایج نشان داد که بیشترین مقدار مشخصه‌های القای کالوس مورد مطالعه در محیط کشت حاوی ترکیب اکسین و سیتوکنین (6 mgl-1 iba+1 mgl-1 bap) مشاهده گردید. نتیجه‌گیری کلی: به‌طور کلی نتایج نشان داد که در حالت عادی و بدون اعمال هیچ تیماری تا 90 درصد احتمال کنترل قهوه‌ای شدن ریزنمونه‌های سرشاخه‌های طبیعی زالزالک خونین وجود دارد. برای ضدعفونی ریزنمونه‌ها استفاده از کلرید جیوه نیم‎درصد به‌مدت 16 دقیقه پیشنهاد می‌شود. ترکیب تنظیم‌کننده‌های رشد در محیط کشت برای القای کالوس زالزاک خونین بسیار مناسب ارزیابی شد. ارائه نتایج این پژوهش می‌تواند دستورالعمل آزمایشگاهی برای باززایی و پرآوری زالزالک خونین فراهم کند.  

optimization of in vitro cultivation conditions of blood hawthorn (crataegus atrosanguinea)

background: it is important to research in the field of germplasm protection of native and medicinal tree species in northern iran forests, especially blood hawthorn with many medicinal properties. sexual reproduction of hawthorn is possible with apomixis due to the thick shell and two types of physical and physiological dormancy, and its asexual reproduction by rooting cuttings faces many problems. bloody hawthorn (crataegus atrosanguinea from the rosaceae family) is considered one of the valuable species of the forests of the north and west of the country, which is very important due to its fruitfulness, very strong wood, and numerous medicinal properties. the medicinal properties of hawthorn have been proven in the treatment of blood pressure, arteriosclerosis, heart congestion, heart muscle weakness, and coronary insufficiency. hawthorn contains many secondary metabolites such as flavonoids proanthocyanidin and glycosides. optimizing the in vitro cultivation conditions of blood hawthorn as one of the natural species of iran can be a suitable solution for its propagation. the present research was carried out to control pollution, control browning, and induce the callus of blood hawthorn (c. atrosanguinea) in vitro. controlling the contamination of explants, seeds, and plant tissues is of great importance for the success of plant tissue culture. since the enrichment of natural plant explants is a priority for tissue culture, this is usually associated with many problems with browning, especially for woody plants that have a thick and woody stem. determining the type and concentration of the growth regulator of a variable factor is necessary for the growth of plants under in vitro conditions. after applying the growth regulator to the culture medium, the plant will show different reactions, but one of the appropriate ways to choose the correct path of plant regeneration is to determine the wet and dry weights of the callus, which is widely measured as a standard of callus growth. the callus growth curve can be obtained using the wet and dry weights of the callus. the results of past research indicate a wide range of changes in the type and concentration of growth regulators on callus formation and regeneration of different species of the hawthorn genus. a specific type and concentration of growth regulators should be applied according to the type of plant species.methods: young and healthy stems of blood hawthorn were collected from larijan in amol, mazandaran province, iran, with geographical coordinates of 38’ 58° n and 10’ 52° e, at the beginning of the growing season. the collected stems were immediately transferred to the plant tissue culture laboratory of the faculty of natural resources at sari university of agriculture and natural resources, iran. disinfection of natural hawthorn stems is very necessary due to surface and tissue contamination. for this purpose, explants of 0.5-1 cm size were cut from the stems. the infection control treatments included hgcl2, h2o2, naclo, and agno3, and five treatments were designed to control the browning of explants. browning control treatments included control, running water, ascorbic acid, polyvinyl chloride, and activated charcoal. in general, the culture medium consisted of substances including mineral salts (micro- and macroelements) as providers of maximum growth, amino acids and vitamins as nitrogen sources, sugar as a source of carbon and energy, growth regulators as growth and morphogenesis stimulants, agar as the solidifier of the cultivation medium, and water, which includes 90% of the cultivation medium. in this research, the culture medium was ms, which was first created by driver and koniaki (1984) and prepared according to dufussard (1976). in this study, the ph of the culture medium was set to 5.8. for callus induction, iba, naa, 2,4-d, bap, tdz, and kin treatments at three concentration levels of 0.1, 1, and 6 mg/l and a combination of naa (6 mg-1) + bap (1 mg-1), and iba (6 mg l-1) + bap (1 mg-1) were used in the ms culture medium. stem explants were placed horizontally on the culture medium. among different callus treatments, callus percentage, degree of callus, callus fresh and dry weights, and cross-sectional area of callus were measured to investigate callus induction. the best treatment was obtained by calculating the mentioned characteristics and that treatment was used for planting. it was transplanted approximately every 20 days and a total of 5-6 times. after callus cultivation in the reproduction medium, the explants were placed in a culture chamber and adaptation racks under 16 hours of light and 8 hours of dark treatment at 25 ± 2 °c with a humidity of 70%.results: hgcl2 (0.5%, 16 minutes) with an average of 100% health was the most appropriate pollution control treatment. the control treatment with 98% health was observed as the most appropriate browning control treatment. moreover, the type, concentration, and interaction effect of the type and concentration of the growth regulator significantly affected the callus induction characteristics of blood hawthorn (p < 0.01). the highest fresh and dry weights of callus, percentage and degree of callus formation, and cross-sectional area of callus were observed among auxin and cytokinin treatments, respectively, for 6 mg/l of naa and 1 mg/l of bap treatments. the highest levels of the studied callus induction characteristics were observed in the culture medium containing the combination of auxin and cytokinin (6 mg-1 of iba+1 mg-1 of bap).conclusion: in general, the results showed a 90% chance of controlling the browning of the explants of natural blood hawthorn branches in a normal state and without applying any treatment. it is recommended to use 0.5% mercuric chloride for 16 minutes to disinfect the explants. the combination of growth regulators in the culture medium was evaluated as very suitable for the callus induction of bloody hawthorn. the results of this research can provide laboratory instructions for the regeneration and mass reproduction of blood hawthorn.