طراحی و بهینه‌سازی سیستم الایزای نقطه‌ای (dot-blot elisa) با آنتی‌ژن‌های اختصاصی برای تشخیص ساده و سریع مشمشه

مقدمهمشمشه از قدیمی‌ترین بیماری‌های واگیر خطرناک و مشترک بین انسان و حیوان است که با ظهور جراحات گرانولوماتوزی قرحه‌ای در پوست و غشاهای مخاطی مشخص می‌شود. با توجه به گزارش حتی یک مورد بیماری و لزوم جلوگیری از انتشار آن با شناسایی و معدوم‌سازی میزبان‌های آلوده، شناسایی زودهنگام بیماری با روش‌های حائز حساسیت و ویژگی قابل قبول، از اهمیت بالایی برخوردار است. مطالعۀ حاضر به ‌منظور طراحی و بهینه‌سازی سیستم الایزای نقطه‌ای (dot-blot elisa) با آنتی‌ژن‌های اختصاصی جهت تشخیص ساده و سریع مشمشه در نمونه‌های سرمی اسب‌سانان انجام گرفت.مواد و روش‌هاسویه‌های بورخولدریا مالئی در محیط مایع نوترینت همراه با گلیسیرول 4 درصد کشت داده شدند. آنتی‌ژن‌های کل سلول باکتری با استفاده از روش سونیکاسیون و ترسیب با تری‌کلرو استیک اسید (tca) استخراج شد. غلظت بهینه آنتی‌ژنآنتی‌بادی با روش تیتراسیون چکر بورد معین شد. آنتی‌ژن باکتری روی کاغذ نیتروسلولز مفروش و بعد از متوقف‌سازی با شیرخشک، سرم حیوان مشکوک و سپس آنتی‌بادی کونژوگه شده با hrp اضافه گردید و با استفاده از سوبسترای tmb، سیگنال‌ها رهگیری شد.یافته‌هاتعداد 4 نمونه از 90 نمونۀ سرم با استفاده از آزمون الایزای نقطه‌ای، مثبت گزارش شد. ویژگی و حساسیت آزمون، به‌ترتیب 96/62 و 100 درصد برآورد گردید. کشت و جداسازی بورخولدریا مالئی از نمونه‌های بالینی حیوان، اعتبار تست را تایید کرد. نتیجه‌گیرییافته ‌ها نشان داد روش الایزای نقطه‌ای حائز حساسیت، ویژگی و دقت بالا در تشخیص مشمشه بوده و به‌ دلیل سرعت، سهولت تفسیر بدون نیاز به ابزار خاص، مقرون به‌صرفه بودن و قابلیت کاربردی صحرایی آن، روش کاربردی و کارآمد می ‌باشد.

Design and optimization of Dot-blot ELISA system using specific antigens for simple and rapid diagnosis of glanders

IntroductionGlanders is one of the oldest contagious and dangerous zoonotic diseases manifesting ulcerative granulomatous lesions on the skin and mucous membranes. Early methods possessing desirable sensitivity and specificity is important to diagnose the disease considering the just only one case report and preventing disease by identification and eradication. The present study was aimed to design and optimize Dotblot ELISA system using specific antigens for simple and rapid detection of glanders using equine sera samples.Materials MethodsBurkholderia mallei strains were cultured in nutrient broth supplemented with glycerol 4%. Whole cell antigens of bacterial strains were precipitated by trichloroacetic acid (TCA) followed by sonication method. The optimum concentrations of antigenantibody were determined by checkerboard titration. The nitrocellulose membrane was coated by antigen, then stopped by skimmed milk as a blocker. The suspicious equine serum was added to the membrane following HRPconjugated antibody, the signals were detected by TMB as a substrate.Results 4 out of 90 sera samples were positive by Dotblot ELISA. The specificity and sensitivity of the test were evaluated 96.62% and 100%, respectively. B. mallei culture and isolation from clinical specimens of the horses validated the test.ConclusionOur study showed that the Dotblot ELISA is specific and sensitive in glanders diagnosis and it seems to be practical and efficient test due to the rapid, easy interpretation without any special tools, costeffective and also fieldfriendly.