بیان فاکتور‌های اصلی نوترکیب espa-intiminاز باکتری e. coli o157:h7 در گیاه تنباکو به ‌منظور تولید واکسن خوراکی

یکی از پاتوژن های مهم ایجاد کننده کولیت هموراژیک و نشانگان همولیتیک اورمیک در انسان باکتری اشرشیاکلی هموراژیک سویه o157h7 می باشد. دام ها اصلی ترین مخزن این باکتری می باشند. دو فاکتور پروتئینی با اهمیت در کلونیزاسیون باکتری در اپیتلیوم روده espa و intimin هستند که باعث ایجاد آسیب های تخریبی به واسطه اتصال می گردند. این پروتئین ها توسط جزایر بیماری زایی lee (locus of enterocyte effacement) کد می شوند. espa بخشی از سیستم ترشحی نوع iii میباشد که موجب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان و ورود آن به غشا سلول می شود. اینتیمین توسط ژن eae کد شده و به tir متصل می گردد. این تحقیق بر این اساس است که ژن کایمریک و نوترکیب ei شامل espa و intimin که به واسطه یک لینکر به یکدیگر اتصال یافته اند می تواند به عنوان کاندیدای ایمنی زایی خوراکی در نظر گرفته شود و موجب کاهش کلونیزاسیون o157:h e. coli در مدل حیوانی گردد. بدین منظور ژن سنتتیک espa (120) و intimin (282) که توسط توالی 4(eaaak) به یکدیگر متصل شده بود ساخته شد. ژن ساخته شده بر اساس کدون های گیاه توتون بهینه سازی و سپس تحت کنترل پروموتر camv35s در ناقل بیانی گیاه کلون و پس از آن به واسطه انتقال توسط آگروباکتریوم به گیاه توتون منتقل گردید. ورود ساختار ژنی نوترکیب در برگ های گیاه توتون توسط آزمون pcr تایید شد. در مرحله بعد بیان ژن مورد نظر به روش rtpcr بررسی و تایید گردید. در نهایت میزان پروتئین ei در برگ های توتون تراریخته توسط روش الیزا تخمین زده شد که برابر با 1/0 درصد از کل پروتئین محلول در برگ گیاه بود.

Expression of Recombinant Chimeric EspA-intimin Protein in Nicotiana tobaccum for Oral Vaccine Development

One of the important pathogens which cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome in humans is enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7. Cattle are the most important reservoir of this bacterium. EspA and Intimin are two protein factors for bacteria colonization on intestinal epithelium and cause attaching/effacing lesion. The LEE pathogenicity islands code these proteins. EspA is part of type III secretion systems which delivers Tir to the host cell and integrate to membrane. Intimin encoded by eae gene and fused to Tir. In this research we supposed that chimeric recombinant form of EI gene containing EspA and Intimin were fused with a linker as an edible candidate vaccine would reduce colonization of E. coli O157:H7 in animal model. We constructed a synthetic gene EspA (E120) and intimin (Int282) fused by (EAAAK)4 sequence. The synthetic gene (EI) was codon optimized and subcloned into plant expression vector (PBI121) under CaMV35S promoter and then transferred to tobacco plant by agrobacterium mediated protocol. The presence of inserted gene in plant genome was documented by PCR and RTPCR methods. The amount of EI protein in transgenic tobacco leaves were estimated 0.1% of the total soluble protein (TSP) by ELISA method.