همسانه‌سازی، انتقال و بیان دائم فیوژن ژن‌های اینترفرون گامای انسانی و bar در گیاه توتون

تولید پروتئین اینترفرون گامای انسانی در سیستم های بیانی یوکاریوتی، به عنوان یک پروتئین نوترکیب درمانی، در مطالعات پزشکی اهمیت بسیاری دارد. ویژگی های اینترفرون گاما، آن را به یک فاکتور ضد سرطانی مناسب تبدیل کرده است. فسفینوتریسین (ppt) مهارکننده گلوتامین سینتاز است و از گروه علف کش های غیرانتخابی بیالافوس می باشد. ژن bar کد کننده آنزیم فسفینوتریسین استیل ترانسفراز (pat) است. این آنزیم باعث ایجاد مقاومت به علف کش فسفینوتریسین می شود و می تواند به عنوان یک نشانگر انتخابی در گیاهان استفاده شود. در این پژوهش، ژن اینترفرون گامای انسانی و ژن bar به صورت فیوژن در ناقل بیانی گیاهی pcambia 1305.1 تحت کنترل پیش برنده camv35s و خاتمه دهنده nos همسانه سازی شد. صحت همسانه سازی فیوژن ifn gamma; barدر ناقل بیانی حاضر با استفاده از تکنیک های مختلفcolony pcr، هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. سازه ی تهیه شده (pcambia1305.1 ifn gamma; bar) با استفاده از روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه ی lba4404 انتقال داده شد و با استفاده از روش دیسک برگی در ژنوم گیاه توتون ادغام شد. گیاهان تراریخته احتمالی در محیط گزینشگر، حاوی 30 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین انتخاب شدند. پس از ریشه دار شدن به خاک انتقال یافتند و حضور فیوژن ifn gamma; barدر ژنوم این گیاهان با استفاده از تکنیک pcr تایید شد. در آنالیز دات بلات نیز حضور پروتئینifn gamma;bar در گیاهان تراریخت توتون تایید شد.

Cloning, Transformation and Stable Expression of a Fusion of Human Interferon Gamma and bar Genes in Tobacco Plant (Nicotiana tobaccum cv. xanthi)

The production of human gamma interferon in eukaryote expression systems refers as a therapeutic recombinant protein which has significant impact in medical studies. Unique com position of gamma interferon makes such protein as a suitable tool against cancer. It is documented that phosphinothricin (PPT) classified as nonselective herbicide group of bialaphos acts an inhibitor for glutamine synthetase. The bar gene is encoding the phosphinothricinNacetyltransferase (PAT) enzyme. This enzyme capable of boosting resistance against PPT herbicide, thus it can be selected as a selective marker within plant population. Then various colony PCR techniques, enzymatic digestion and sequencing were used to confirm the accuracy of fusion of IFN gamma;bar gens within expression transporter. Using freezing and thawing method to transfer the pCAMBIA1305.1 IFN gamma;bar construction into strain of LBA4404 of agrobacterium, then disc leaves was used to integrate into the genomic of tobacco plant. The transgenic plants were selected under selector condition which possess 30 mg/l of hygromycin. After the developed roots were transferred into soil, and PCR technique was used to confirm the presence of IFN gamma;bar in the genomic of plants. Dot blot analysis was applied to detect IFN gamma;bar protein in transgenic of to tobacco plants.