طراحی و بیان پروتئین سه‌جزئی mglp1-darpin-pen با پتانسیل مصرف خوراکی برای درمان دیابت نوع 2 در کلروپلاست توتون

شیوع جهانی دیابت نوع 2 به‌طور مداوم در حال افزایش بوده و در حال حاضر هیچ درمان قطعی برای دیابت نوع 2 وجود ندارد. پپتید شبه گلوکاگون-1 (glp-1) به‌عنوان یک هورمون طبیعی اینکرتینی کوچک تولید انسولین را به شیوه‌ی وابسته به گلوکز افزایش می‌دهد. با این حال، نیمه‌عمر بسیار کوتاه glp-1 کاربرد درمانی آن را محدود می‌کند. از دارپین متصل شونده به آلبومین می‌توان برای افزایش نیمه‌عمر سرمی پروتئین‌های دارویی، پپتیدها و ترکیبات کوچک استفاده کرد. در این مطالعه، یک نسخه طولانی اثر با پتانسیل خوراکی از آگونیست گیرنده glp-1 شامل glp-1 مقاوم به پروتئاز، به‌صورت همجوش با دارپین متصل شونده به آلبومین و پنتراتین به‌عنوان پپتید نفوذکننده به سلول، به‌صورت کپسوله شده در کلروپلاست برای محافظت در برابر سیستم گوارش در سلول‌های گیاهی توتون بیان شد. تراریختی موفق کلروپلاست‌های توتون با ژن‌های رمزکننده پروتئین همجوشی به‎‌واسطه ناقل‌ کلروپلاستی pprv111a و با استفاده از تفنگ ژنی انجام شد. گیاهان ترانسپلاستوم هموپلاسم پس از سه دوره گزینش در محیط گزینش حاوی 500 میلی‌گرم در لیتر از اسپکتینومایسین و استرپتومایسین به‌دست آمدند. درج تراژن و وضعیت هموپلاسمی‌ در گیاهان ترانسپلاستوم توسط pcr و لکه‌گذاری سادرن تایید گردید. آزمون لکه‌گذاری وسترن تجمع پروتئین همجوشی سه‌جزئی mglp1-darpin-pen در گیاهان ترانسپلاستوم را تایید نمود و محتوی پروتئین همجوشی تولید شده در کلروپلاست گیاهان ترانسپلاستوم با استفاده از الایزا، 8/21 درصد پروتئین محلول کل برگ برآورد شد. بیان موفق پروتئین همجوشی طراحی شده در این مطالعه نشان می‌دهد که تولید glp-1 در گیاهان، می‌تواند یک شکل ارزان ‌قیمت و خوراکی از این دارو را برای درمان دیابت نوع 2 فراهم کند.

design and expression of mglp1-darpin-pen trivalent protein with oral potential for type 2 treatment in tobacco chloroplasts

the global prevalence of type 2 diabetes mellitus is continuously increasing, and there is currently no definitive cure for type 2 diabetes. the potent glucagon-like peptide 1 (glp-1), a natural small incretin hormone, enhances insulin secretion in a glucose-dependent manner. however, the exceedingly short half-life of glp-1 limits its therapeutic applications. albumin-binding darpin can be used to increase the serum half-lives of therapeutic proteins, peptides, and small compounds. in this study, a long-acting glp-1 agonist with oral delivery potential containing a protease-resistant glp-1, an albumin-binding darpin, and penetratin as a fusion protein was expressed in a bioencapsulated form within tobacco chloroplasts to confer digestive system protection in plant cells. the successful transformation of tobacco chloroplasts with trivalent fusion protein-coding genes was conducted using a pprv111a chloroplastic expression vector and a gene gun. homoplasmic transplastomic plants were obtained after three rounds of selection in selection medium containing 500 mg/l spectinomycin and streptomycin. transgene integration and homoplasmic status in the transplastomic plants were confirmed by pcr and southern blot analyses. western blot analysis confirmed the accumulation of the mglp1-darpin-pen fusion protein in the chloroplasts of the transplastomic plants. the fusion protein content estimated by elisa was 21.8% of the total soluble protein content in the transplastomic plants. the successful expression of the designed fusion protein indicated that the production of functional glp-1 in plants may facilitate the development of a low-cost, orally deliverable form of this protein for the treatment of type 2 diabetes.