بیان و بررسی خاصیت ضد‌میکروبی پروتئین نوترکیب cbd-alfafp در کلون‌های ریشه موئین گیاه توتون علیه بیمارگر‌های گیاهی

بیان پپتید ‌های ضدمیکروبی در گیاهان رویکرد‌ جدیدی برای حفاظت از گیاهان در برابر بیمارگر ها و تولید دارو ‌های ضد میکروبی در صنایع داروسازی است. پپتید کاتیونی alfafp یک دیفنسین گیاهی با فعالیت ضد‌میکروبی است که توسط بذر های گیاه یونجه تولید می‌ شود. به‌منظور افزایش کارایی و تسهیل دسترسی پپتید alfafp به دیواره سلولی بیمارگر ها، توالی رمز کننده alfafp به پایانه c دمین متصل‌شونده به کیتین (cbd) آنزیم کیتیناز برنج متصل شد. ابتدا خواص ضد میکروبی این پپتید نوترکیب با استفاده از ابزار‌ های بیوانفورماتیک مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت، سامانه ژنی پس از انتقال به پلاسمید بیانی pgsa1285 وارد اگروباکتریوم رایزوژنز (rhizobium rhizogenes) و از آن برای تولید ریشه ‌های موئین در توتون استفاده گردید. حضور تراژن، رونویسی و بیان آن در کلون ‌های ریشه‌ موئین گیاه توتون، به‌ترتیب با استفاده از روش ‌های pcr و rt-pcr نیمه‌کمی تایید شد. نتایج حاصل از پیش‌بینی ساختار سه‌بعدی پپتید، یک صفحه β و یک مارپیچ α را نشان داد که با ساختار دیفنسین‌های گیاهی مطابقت داشت. همچنین در این مطالعه، دمین عملکردی knottin در ساختار پپتید نوترکیب شناسایی شد که نشان می ‌دهد پپتید نوترکیب فعالیت ضدمیکروبی خود را حفظ می کند. نتایج خاصیت ضد میکروبی حاصل از آزمایش cfu نشان داد که پپتید نوترکیب دارای اثرات بازدارندگی معنی‌ داری در جلوگیری از رشد بیمارگر باکتریایی pseudomonas syringae بود. بنابراین، دمین متصل‌شونده به کیتین دسترسی پپتید نوترکیب را به دیواره سلولی بیمارگر باکتریایی از طریق اتصال به پپتیدوگلیکان فراهم کرده و احتمالاً پپتید نوترکیب توانسته است غشاء پلاسمایی را با کارایی بهتری هدف قرار دهد. معرفی و بیان پپتید نوترکیب cbd-alfafp در ریشه ‌های موئین و گیاهان زراعی مهم می‌تواند ابزاری امیدبخش برای ایجاد گیاهان مقاوم به بیمار‌گر های گیاهی و تولید عوامل ضدمیکروبی در صنعت داروسازی باشد.

expression and antimicrobial activity assessment of cbd-alfafp recombinant peptide produced in tobacco hairy roots against plant pathogens

expression of antimicrobial peptides (amps) in plants to resist plant pathogens as well as to produce novel amps for pharmaceutical applications has recently received much consideration. alfafp, a defensin cationic peptide synthesizing in alfalfa seeds, exhibits a strong antimicrobial activity. in order to facilitate alfafp access to the pathogen’s membrane and increase the activity of the alfafp peptide, the alfafp encoding sequence was fused to the c-terminal of a chitin-binding domain (cbd) from a rice chitinase encoding gene. first, the antimicrobial properties of the recombinant peptide were assessed using bioinformatics tools. next, the pgsa1285 expression vector harboring the cbd-alfafp heterologous dna was transformed into agrobacterium rhizogenes for hairy root (hr) production in tobacco. the presence of transgene, transcription, and the expression of recombinant peptide in the hrs were confirmed by pcr and semi-quantitative rt-pcr analysis, respectively. bioinformatic analysis was used to predict the antimicrobial activity of the alfafp recombinant peptide. the results of the 3d structure analysis revealed a β-sheet and an α-helix structure that corresponded well with the structure of plant defensins. a knottin functional domain was also recognized, suggesting that the recombinant peptide retains its antimicrobial activity. the results of the in vitro antimicrobial activity of the alfafp recombinant peptide using cfu test showed that the recombinant peptide had significant inhibitory effects on pseudomonas syringae pathogen. therefore, the chitin-binding domain provided a better access of the recombinant peptide to the pathogenic bacterial cell wall through binding to peptidoglycan, and probably the recombinant peptide was able to target the plasma membrane with better efficiency. the results of this study suggested that the expression of the cbd-alfafp recombinant peptide in crop plants and hrs can be a promising approach to producing pathogen-resistant plants as well as to produce new recombinant pharmaceutical amps.