انتقال ژن به‌روش آگروباکتریوم و تحلیل گیاهان تراریخت در صنوبر سیاه هیبرید (populus × euromericana dode guinier)

صنوبر سیاه هیبرید (populus × euramericana)، گیاهی با کاربردهای مهم اقتصادی در صنایع خمیرچوب و کاغذ، سوخت زیستی و مواد نانوسلولزی و حذف آلودگی‌های خاک است. در این پژوهش، شیوه‌نامه انتقال ژن به‌روش آگروباکتریوم و باززایی مستقیم گیاه با استفاده از بافت میانگره ساقه صنوبر سیاه هیبرید ارائه و تحلیل مولکولی گیاهان تراریخت انجام شد. جهت باززایی گیاه کامل از کشت ریزنمونه های میانگره ساقه در محیط‌کشت القای ساقه‌زایی حاوی محیط موراشیگ و اسکوگ (ms) و غلظت‌های مختلف ترکیباتbap × iba و برای ریشه زایی (rim) از محیط‌کشت القای ریشه‌زایی حاوی غلظت های iba × naa استفاده شد. با ارزیابی فاکتورهای فیتوهورمونی در باززایی مستقیم، بالاترین میزان باززایی ساقه (28.57 ساقه در هر ریزنمونه) از ریزنمونه‌های کشت شده در محیط‌کشت sim حاوی 0.5 میلی‌گرم بر لیتر bap و 0.05 میلی‌گرم بر لیتر iba به‌دست آمد. بهترین ریشه زایی ساقه های باززا در محیط‌کشت rim حاوی 0.1 میلی‌گرم بر لیتر iba و 0.05 میلی‌گرم بر لیتر naa تولید شد. 100 درصد گیاهان باززا با محیط سازگار شده و به گلخانه منتقل گردیدند. نتایج مربوط به حساسیت به علف‌کش نشان داد که 0.5 میکرومولار basta reg; سیستم گزینش دقیقی جهت مهار سلول‌های غیرتراریخت فراهم می‌آورد. بالاترین فراوانی انتقال ژن (93.33درصد) از طریق پیش‌کشت ریزنمونه‌ها به‌مدت 6 روز و تلقیح آن‌ها با agrobacterium tumefaciens سویه lba4404 ( 0.6=od600 ) همراه 100 میکرومولار استوسرینگان به‌مدت 10 دقیقه به‌دست آمد. آنالیزهای لکه‌گذاری سادرن، rtpcr و آزمون هیستوشیمیایی gus به‌ترتیب درج یک تا دو نسخه ژن gus در dna ژنومی و بیان پایدار آن‌ را در گیاهان نسل t0 منتخب تایید کرد. یافته‌های این تحقیق می‌تواند به‌ عنوان شیوه نامه باززایی و انتقال ژن به گیاه صنوبر سیاه هیبرید مورد بهره‌برداری قرار گیرد.

Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation and Analysis of Transgenic Plants in Hybrid Black Poplar (Populus × euromericana Dode Guinier)

Black poplar (Populus × euramericana Dode Guinier) is an industrially important tree with broad applications in wood and paper, biofuel and cellulosebased industries as well as plant breeding programs and soil phytoremediation approaches. Here, we have focused on development of direct shoot regeneration and Agrobacteriummediated transformation protocols using the in vitro internodal stem tissue from hybrid black poplar. To obtain efficient plant regeneration, the internodal stem explant was cultured on SIM and RIM medium containing different concentrations of BAP × IBA and IBA × NAA, respectively. The crucial factors involved in genetic transformation have been evaluated to achieve Agrobacteriummediated transformation protocol. We achieved fast and highly potential shoot regeneration from the explants cultured on SIM containing BAP 0.5mg/L and IBA 0.05mg/L with 28.57 shoots per explant. The normal roots developed from the plantlets cultured on RIM containing IBA 0.1mg/L and NAA 0.05mg/L and 100% of the regenerated plants were hardened and transferred to the greenhouse condition. Our results indicated that 0.5 micro;M Basta reg; could provide a stringent selection for the inhibition of nontransformed cells. We also obtained the highest transformation efficiency of 93.33% through preculturing the explants for 6 days and dipping into IM medium containing A. tumefaciens strain LBA4404 (OD600 = 0.6) and 100 micro;M AS for 10 min. The Southern blotting analysis, RTPCR and GUS histochemical analysis were confirmed the stable single or twocopies gus transgenesis in the genomic DNA and its expression in the selected T0 generation plants. The findings indicate that these protocols could be used for genetic engineering approaches in hybrid black poplar.