کلونینگ، بیان ژن و خالص سازی کربوکسی پپتیداز جدید از گونه هالوفیل bacillus persicus دریاچه فوق شور آران و بیدگل

پروتئازهای میکروبی به دلیل کاربرد گسترده در صنایع شوینده، دارویی و فرآوری خوراک دام درصد بالایی از کل بازار آنزیم های صنعتی را به خود اختصاص می دهند. گونه‌های جنس bacillus، قابلیت بالایی در تولید و ترشح مقادیر بالای آنزیم پروتئاز را دارند که از فعالیت های فیزیولوژیک آن ها نشات می گیرد. در این مطالعه، ابتدا ژن کد کننده کربوکسی پپتیداز از گونه bacillus persicus به وسیله pcr و با استفاده از آغازگرهای دارای جایگاه‌های برش ndei و xhoi جدا شد. پس از هضم آنزیمی محصول pcr، قطعه ژن در بین جایگاه‌های مورد نظر در حامل بیانی pet28a+ کلون شد و پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی e. coli bl21(de3) ترانسفورم شد. پلاسمیدهایی که colony pcr آنها مثبت بود جهت تایید نهایی برای تعیین توالی ارسال شد. بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط دمایی و در زمان‌های مختلف انجام شد و تخلیص پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز صورت پذیرفت. بیشترین سطح بیان در غلظت 0/4 میلی‌مولار iptg در دمای 32 درجه سانتی‌گراد و مدت زمان 20 ساعت انکوباسیون تعیین شد. وزن مولکولی پروتئین نوترکیب کربوکسی پپتیداز حدود 58 کیلودالتون بود. با توجه به مقدار بالای بیان پروتئین محلول و بهینه‌سازی آسان بیان و خالص‌سازی آن در شرایط آزمایشگاهی، چنانچه فعالیت آنزیمی در حضور سوبستراهای استاندارد به مقدار مناسب باشد و همچنین اگر مطالعات تکمیلی امکان تولید بهینه و به صرفه مقدار بالایی از این آنزیم را در حجم بالا و شرایط نیمه صنعتی نشان دهد، می‌توان امیدوار بود که این آنزیم گزینه مناسبی برای تولید نیمه صنعتی باشد.

cloning, expression and purification of a novel carboxypeptidase from a hypersaline lake halophilic bacillus persicus

microbial proteases have a large portion of the market of industrial enzymes, because of their wide application in detergents, drug enzymes and animal feed processing. bacillus strains potentially produce a significant quantity of proteases, due to their physiological properties. in this study, first, the gene encoding carboxypeptidase from bacillus persicus was isolated by pcr and using primers with ndei and xhoi restriction sites. after digestion of the pcr product, it was cloned into the appropriate site at pet28a+ vector, then recombinant plasmids transformed into e. coli bl21)de3( strain. plasmids with positive colony pcr result were sent for sequencing for final confirmation, then, recombinant enzyme expression was optimized at different temperature and time conditions, then purified with nickel embedded agarose affinity chromatography.  iptg concentration of 0.4mm at 32°c and incubation time of 20 hours provided the maximum amount of enzyme expression. molecular weight of the carboxypeptidase was estimated approximately 58kda. considering the high amount of expression of the soluble protein and the easy optimization of its expression and purification in laboratory conditions, if the enzyme activity in the presence of standard substrates is adequate, and also if additional studies show the possibility of optimal and cost-effective production of a high amount of this enzyme in a large volume and pilot conditions, it can be hoped that this enzyme is a suitable option for industrial purposes.