همسانه‌سازی ژن آنزیم کلسترول‌ اکسیداز سویه بومی ایرانی Rhodococcus Sp. 502 در راستای تولید آفت‌کش بیولوژیکی پنبه

آنزیم کلسترول‌اکسیداز به عنوان نسل جدیدی از آفت کش های بیولوژیک اثر آفت کشی قوی بر روی آفت غوزه پنبه (heliothis armigera) دارد. مکانیسم اثر کشندگی کلسترول‌اکسیداز مربوط به اکسیداسیون کلسترول در غشای اپیتیلیوم روده میانی حشرات می‌باشد که منجر به تخریب فیزیکی و ساختاری غشاء و در نتیجه ایجاد اختلالاتی در عملکرد غشاء و در نهایت سبب مرگ آفت می‌شود. تولید گیاهان مهندسی ژنتیک شده با ژن کدکننده آنزیم کلسترول ‌اکسیداز در جهت مقاوم‌سازی آن ها به آفات، مستلزم انتخاب مناسب‌ترین سوش از نظر میزان بیان و فعالیت زیاد این آنزیم است. لذا این تحقیق با هدف همسانه سازی ژن آنزیم کلسترول‌اکسیداز در یک سیستم بیانی pet مناسب، جهت امکان هدایت پروتئین نوترکیب تولیدشده به فضای پری‌پلاسمی باکتری طراحی و اجرا شد. بدین منظور از ‌سویه باکتری (rhodococcus sp. 502) بومی ایران، که دارای فعالیت کلسترول‌اکسیدازی بالا بود، جهت جداسازی ژن با pcr استفاده شد. محصول pcr ابتدا در پلاسمید خطی pjet و در نهایت در پلاسمید pet23a کلون و داخل میزبان (e.coli dh5α) ترانسفورم شد. پس از همسانه‌سازی و استخراج پلاسمید نوترکیب pet23a+cho و به‌منظور تایید حضور ژن از آنزیم‌های hindiii و xhoi و تعیین توالی استفاده شده است. حضور باند 1600 جفت بازی در هضم آنزیمی  حضور ژن را تایید کرد. نتایج حاصل از آنالیز تعیین توالی حاکی از آن است که توالی به‌‌دست ‌آمده شباهت زیادی با کلسترول‌اکسیداز سویه‌های دیگر باکتری rhodococcusموجود در ncbi دارد، که  از آن می‌توان در راستای تولید آفت‌کش بیولوژیکی در پنبه استفاده نمود.

Cloning of cholesterol oxidase gene from Iranian strain of Rhodococcus for production of cotton biological pesticide

Cholesterol oxidase enzyme, as a new generation of biological pesticides, has pesticides strong effect on the pest to cotton Heliothis armigera. The mechanism of action of cholesterol oxidase fatality related to the oxidation of cholesterol in the membranes of insect midgut epithelial which leads to physical destruction and the resulting disturbances in membrane structure and function and eventually death of the insect. In order to retrofitting genetically engineered plants against pests, production of them with the gene coding for cholesterol oxidase enzyme, require the best method for expression level and activity of this enzyme. Therefore, this study aimed to clone cholesterol oxidase enzyme in plasmid pET23a for possible guidance recombinant protein produced in bacterial periplasmic space. Rhodococcus sp. strain 502 that produce high level of cholesterol oxidase, was used for gene isolation by PCR. The PCR product was sub cloned in  plasmid pJET, subsequently for expression was cloned in pET23a, eventually was transformed into the host E.coli DH5α. Recombinant plasmid pET23a CHO was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The results of sequencing showed high similarity between our isolated gene sequence and the other cholesterol oxidase gene sequences in NCBI that can be used for production of biological pesticide.