تشخیص مولکولی عامل طاعون بر اساس ژن pla

یرسینیا پستیس عامل بیماری طاعون، باسیلی گرم منفی متعلق به تیره انتروباکتریاسه است. تشخیص این ارگانیسم بر اساس روش های کلاسیک وقت گیر، پر هزینه و خطرناک است. هدف از این مطالعه طراحی روش taqman realtime pcr برای تشخیص سریع این باکتری بر اساس ژن pla است. در این مطالعه واکنش realtime pcr بر اساس ژن هدف pla بهینه سازی گشت. برای تعیین حساسیت، از ژن pla رقت های سریال تهیه و آخرین رقتی که سیگنال فلورسنت تولید کرد به عنوان کم ترین حد تشخیص در نظر گرفته شد. بر اساس نتایج آزمایش تعیین حساسیت، منحنی استاندار شامل مقادیر ct و تعیین کمیت برای آنالیز ژن هدف استفاده گردید. ویژگی آنالیتیکال روش به وسیله انجام آزمایش بر روی ژنوم تعدادی از باکتری های کنترل منفی ارزیابی گردید. در این بررسی، در نمودار تکثیر ژن pla هیچ گونه تکثیری برای نمونه های کنترل منفی مشاهده نشد و ویژگی واکنش تایید گشت. کم ترین حد تشخیص روش realtime pcr برای ژن هدف fg 4/5، همچنین کم ترین تعداد کپی از ژن هدف در یک واکنش 20 میکرولیتر در حدود 3 10 × 1 تعیین گشت..

The molecular detection of the causative agent of plague on the basis of the pla gene

Yersinia pestis, a gramnegative rod belonging to the Enterobacteriaceae family, is the causative agent of plague. Classical methods of detecting the organisms are timeconsuming, expensive and dangerous. The aim of the study was to design a Realtime PCR assay on the basis of the pla gene of Yersinia pestis. In this research the Real time PCR test was optimized by using special primers for targeting pla gene. After preparing 10fold serial dilutions of the pla and their analysis by the assay, the last dilution showing a fluorescent signal was confirmed as the limit of detection (LOD). A standard curve based on the Ct values was depicted, so the assay was developed to quantify the target gene. The analytical specificity was determined by subjecting the genome of some control negative bacteria to the assay. In this experiment, negative control genomes did not show detectable signals in the assay. The last dilution of pla plasmid which showed a fluorescent signal was 4.5 fg. So, the lower detectable copy numbers of the gene in a 20 mu;l PCR reaction was calculated as 1 ×;103.