شناسایی و بیان نوترکیب ایزوفرم ژنی سنتز کننده کروسین در کلاله زعفران

وجود ایزوفرم های ژنی مختلف در گیاهان منجر به ایجاد ایزومرهای مختلف از متابولیت ها به مانند متابولیت های گلیکوزیله شده می گردند. در تحقیق حاضر به شناسایی و بیان هترولوگ ایزوفرم ژنی کدکننده آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز کلاله گیاه زعفران در مرحله گرده افشانی پرداخته شد. نتایج حاصل از توالی‌یابی و آنالیز های بیوانفورماتیکی توالی ژنی جدا شده از ژنوم گیاه زعفران با استفاده از آغازگرهای هرزگرد نشان داد که این توالی ژنی با اندازه 1368 جفت باز متعلق به خانواده پروتئینی گلیگوزیل ترانسفرازها بوده که بصورت آپو‌پلاستی در سلول ترشح می گردد. جهت بررسی عملکرد آنزیمی، ابتدا توالی کامل ژنی ایزوله شده با تکنیک gibson assembly در وکتور بیانی pthiougt تحت پروموتر القایی آرابینوز، ساب کلون شده و با روش الکتروپوراسیون در سویه باکتریایی bl21pgro که بیان کننده پروتئین های چاپرونی با زیرواحدهای  elو es بود ترارریخت گردید. پروتئین های بیانی به دنبال تخریب دیواره باکتری با روش فراصوت و سوسپانسیون سازی رسوب باکتری در محلول pbs، به روش جوشانیدن استخراج شد. نهایتاً جداسازی پروتئین های نوترکیب با بارگذاری روی ژل 10%sdspage نشان داد که حاصل بیان هترولوگ ایزوفرم ژنی آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز پروتئینی با وزن مولکولیkda  69/5 می‌باشد. نتایج حاصل از این پروژه می تواند در تعیین استراتژی های اصلاح نژادی برای بهبود صفات کیفی و کمی مانند رنگ و عطر در گیاه زعفران به کار گرفته شوند.

Identification and recombinant expression of Crocin synthesis isoform gene in Saffron stigma

The existence of isoform genes in plants led to the creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to CsUGT protein family which has Apo plastic secretion in the cell. to evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was subcloned under arabinose induce promoter in pThioUGT expression vector by Gibson assembly technique, then the recombinant vector transformed into BL21pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by boiling method. Finally, the protein electrophoresis by SDS pages10% was showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69/5 kDa molecular weight. The gained results in this project could be applied to determine the breeding’s strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.